木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物產(chǎn)物自由基清除活性評(píng)價(jià)

王 琪, 李 慧,陸文偉,周泉城

(1.山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院 ，山東 淄博 255049；2.山東理工大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品功能化技術(shù)山東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255049)

擠壓技術(shù)具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)率高、能量損耗低、功能種類(lèi)多的優(yōu)點(diǎn). 擠壓過(guò)程中，在溫度、壓力和剪切力作用下，豌豆蛋白會(huì)發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂、重新結(jié)合、大分子失去原有的結(jié)構(gòu)、小分子發(fā)生聚合或降解等，從而使原料的生物活性、理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值發(fā)生變化[4-6]. 在擠壓過(guò)程中，在溫度、壓力和剪切力的作用下，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力減弱，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展，由球狀轉(zhuǎn)為纖維狀，并使分子間氫鍵、二硫鍵等化學(xué)鍵斷裂[7]. 經(jīng)過(guò)擠壓之后，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)交聯(lián)作用加劇，使得一些共價(jià)鍵生成. 此外，擠壓后的物料游離氨基的含量增加，使得擠出物的消化率升高，蛋白質(zhì)的酶解速度加快[7]. 因此，研究擠壓、特別是酶聯(lián)合擠壓過(guò)程中豌豆蛋白的結(jié)構(gòu)變化具有重要意義，并可為豌豆蛋白的后續(xù)加工提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參數(shù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木瓜蛋白酶購(gòu)自濟(jì)寧元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力為50 234 u/g. 豌豆蛋白購(gòu)自煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司，主要組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為水分4.62±0.02%，蛋白質(zhì)73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%，此蛋白為原料豌豆蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)為豌豆蛋白.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

單螺桿擠壓機(jī)由山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院研制，單螺桿擠壓機(jī)的長(zhǎng)徑比是16.7.

1.3 試驗(yàn)操作

1.3.1 豌豆蛋白的擠壓處理

稱(chēng)取2 kg豌豆蛋白粉，含水率25%. 擠壓條件如下：機(jī)筒溫度60℃，螺桿轉(zhuǎn)速170 r/min，模孔孔徑12 mm. 擠出物冷卻、干燥、粉碎，100目篩選，裝袋儲(chǔ)存，稱(chēng)為豌豆蛋白擠出物.

1.3.2 豌豆蛋白擠出物的酶解

稱(chēng)取一定質(zhì)量的豌豆蛋白和由節(jié)1.3.1得出的豌豆蛋白擠出物樣品，加入一定質(zhì)量的木瓜蛋白酶和一定pH值的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置于恒溫振蕩水浴鍋中，振蕩酶解3 h，結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min. 冷卻后，將木瓜蛋白酶解液過(guò)濾，濾液稱(chēng)為酶解物.

1.4 抗氧化活性響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

查閱相關(guān)資料及文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)加酶量、溫度、pH、底物濃度為影響酶解條件的4個(gè)顯著因素，因此，選擇此4個(gè)因素為實(shí)驗(yàn)因素. 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究大致確定實(shí)驗(yàn)因素的用量范圍，利用抗氧化活性作為評(píng)判指標(biāo)，確定顯著用量范圍進(jìn)而得出實(shí)驗(yàn)因素的5個(gè)水平，運(yùn)用SAS 9.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，得出最佳的酶解條件.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Response surface experimental data

1.5 酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

1.5.1 DPPH清除率的測(cè)定

根據(jù)Dike Teng[8]的方法，加以改動(dòng). 實(shí)驗(yàn)組取濾液1 mL，加入試管中. 并加入4 mL濃度為0.1 mol/L的DPPH溶液，其中DPPH溶液用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液作為溶劑配制. 避光靜置30 min后，在517 nm下測(cè)定吸光度(Asample).

對(duì)照組以1 mL的蒸餾水代替濾液，實(shí)驗(yàn)步驟與上述相同(Acontrol). 空白組以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液來(lái)代替DPPH溶液，實(shí)驗(yàn)步驟與上述相同(Ablank). 參比為1 mL蒸餾水和4 mL的5%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液. 計(jì)算公式如下：

清除率%=

[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%

1.5.2 OH清除率的測(cè)定

采用鄰二氮菲法[9]，做適當(dāng)修改. 實(shí)驗(yàn)組取2 mL濾液于試管中，加入2 mL的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.4)，再加入1 mL1.8 mM的鄰二氮菲溶液和1 mL 1.8 mmol/L的FeSO4水溶液，迅速混勻. 最后在混合液中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)0.02%的雙氧水，于37℃下水浴60 min，冷卻后在536 nm下測(cè)定吸光度，記為As.

對(duì)照組以蒸餾水代替濾液，實(shí)驗(yàn)步驟與上述相同(Ac). 空白組用蒸餾水代替濾液和雙氧水，實(shí)驗(yàn)步驟與上述相同(Ab). 參比為5 mL的磷酸鹽緩沖溶液與2 mL蒸餾水的混合溶液. 計(jì)算公式如下：

清除率%=[(As-Ac)/(Ab-Ac)]×100 %

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)操作3次平行，利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，Duncan test確定平均值差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物抗DPPH清除率實(shí)驗(yàn)

以DPPH清除率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的DPPH清除率的回歸方程為：

DPPH清除率=-292+3.37A+4.29B+61.3C+12.5D+0.009AB+0.0506AC+0.297×AD+0.0643BC-0.0689BD+0.0663CD-0.259A2-0.0363B2-5.13C2-0.897D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的DPPH清除率的回歸方程方差分析表，見(jiàn)表2.

由表2可知，所建模型是顯著的，失擬項(xiàng)是不顯著的. 且加酶量(A)和pH的交互項(xiàng)(AC)影響顯著，加酶量的二次項(xiàng)(A2)、溫度的二次項(xiàng)(B2)、pH二次項(xiàng)(C2)、底物濃度的二次項(xiàng)(D2)的影響極顯著. 由F值可知，各因素對(duì)豌豆蛋白擠出物酶解液DPPH清除率的影響次序：pH>底物濃度>加酶量>酶解溫度. 加酶量和底物濃度對(duì)酶解度的交互作用比其他交互作用更明顯. 趙翊君等[10]研究了辣木籽酶解產(chǎn)物的DPPH清除能力，研究證明了蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的DPPH清除率. 本研究的結(jié)果與趙翊君等的研究結(jié)果相一致. 根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對(duì)DPPH清除率影響的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖1.

表2 DPPH清除率方差分析Tab.2 Variance analysis for the scavenging rate of DPPH

通過(guò)響應(yīng)曲面圖1，可以進(jìn)一步看出加酶量、pH、溫度、底物濃度，任何2個(gè)因素對(duì)DPPH清除率的交互影響. 由圖1可以看出各因素存在極值點(diǎn)，即有最優(yōu)值，且各因素的相應(yīng)曲面圖在底面的投影呈圓形或橢圓形，極值點(diǎn)落于圓心處，說(shuō)明4個(gè)因素的水平值選擇合理，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性.

圖1 DPPH清除率響應(yīng)曲面圖Fig. 1 Response surface plot of the scavenging rate of DPPH

2.2 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物·OH清除率實(shí)驗(yàn)

以·OH清除率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的·OH清除率的回歸方程為：

·OH 清除=-2637+84.5A+19.1B+389C+102D-0.275AB+0.009AC-0.584AD-0.301BC-0.061BD+1.16CD-2.66A2-0.107B2-29.3C2-6.99D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白·OH清除率的回歸方程方差分析表，見(jiàn)下表3.

表3 ·OH清除率方差分析Tab.3 Variance analysis for the scavenging rate of ·OH

由表3可知，所建模型是顯著的，失擬項(xiàng)是不顯著的. 加酶量的二次項(xiàng)(A2)、pH的二次項(xiàng)(C2)、底物濃度的二次項(xiàng)(D2)影響極顯著. 由F值可知，各因素對(duì)豌豆蛋白擠出物酶解液·OH清除率的影響次序：pH>底物濃度>酶解溫度>加酶量. 這與馬薩日娜的研究結(jié)果相一致[11]. 根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖2.

圖2 各因素對(duì)·OH清除率的響應(yīng)曲面圖Fig. 2 Response surface plot of the scavenging rate of ·OH

通過(guò)響應(yīng)曲面圖2，可以進(jìn)一步看出加酶量、pH、溫度、底物濃度，任何2個(gè)因素對(duì)·OH清除率的交互影響. 由圖2可以看出各因素存在極值點(diǎn)，即有最優(yōu)值，且在底面的投影呈圓形或橢圓形，極值點(diǎn)落于圓心處，說(shuō)明4個(gè)因素的水平值選擇合理，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性. ·OH清除率隨著底物濃度的增加而增加最終趨于平緩；而隨著加酶量、pH、溫度的升高先升高后降低.

2.3 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物抗氧化最佳酶解條件

以DPPH清除率、·OH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)回歸方程進(jìn)行偏微分，得出最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.6℃、pH6.50、底物濃度0.071g/mL.

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)驗(yàn)證，在節(jié)2.3最佳酶解條件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為98.2±0.21%、84.5±0.15%，與在此條件下預(yù)測(cè)值DPPH清除率、·OH清除率分別為98.3%、84.7%方差分析無(wú)顯著性差異. 這說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，可用于豌豆蛋白擠出物抗氧化性預(yù)測(cè)及酶解條件篩選.

3 結(jié)束語(yǔ)

經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)操作及軟件分析可得出木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.6℃、pH6.50、底物濃度0.071g/mL. 此條件下，DPPH清除率、·OH清除率預(yù)測(cè)值分別為98.3%、84.7%，與驗(yàn)證結(jié)果相符.該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，可用于豌豆蛋白的生產(chǎn)預(yù)測(cè)和工藝開(kāi)發(fā).

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