探討γδT細胞在小鼠胰島移植排斥反應中的作用*

李傳貴,宋亞軍,楊加彩,黃赤兵△

(1.解放軍第八十八醫院泌尿外科，山東泰安 271000；2.陸軍軍醫大學新橋醫院泌尿外科，重慶 400037)

Ⅰ型糖尿病是一種T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病，屬于器官特異性自身免疫性疾病。目前胰島移植是治療Ⅰ型糖尿病的理想方法，Edmonton方案(即應用不含激素的免疫抑制劑，并采用改良的非連續密度梯度離心法分離胰島，使胰島移植治療Ⅰ型糖尿病的成功率大幅度提高)的推廣，標志著胰島移植具備了臨床應用的實際價值，但是胰島移植后移植物長期存活仍是一個有待解決的關鍵問題。其中，排斥反應是導致移植后器官功能喪失的最主要原因，是移植物長期存活的主要障礙[1-3]。激活后的γδT細胞可內源性誘導Treg細胞、分泌白細胞介素(IL)-10和轉化生長因子-β(TGF-β)等免疫抑制因子，從而發揮免疫抑制作用。結合以上觀點，本文設計小鼠胰島移植模型，進一步探討γδT細胞在胰島移植排斥反應中的作用[3]。

1 材料與方法

1.1材料 Bablc小鼠，8～12周齡，雄性，若干，作為供體,分離提取胰島細胞。野生型C57小鼠，8～12周齡，雄性，健康狀況良好設為野生型小鼠組；部分野生型C57小鼠用于提取腸上皮內γδT細胞，純化后回輸到γδ敲基因小鼠體內以此設立γδ敲基因回輸γδT細胞小鼠組；γδ敲基因小鼠,8～12周齡，雄性，健康狀況良好，設為γδ敲基因小鼠組，分別建立Ⅰ型糖尿病模型。所有小鼠均購于陸軍軍醫大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(渝)201020102、SCXK(軍)20102007，清潔(SPF)級實驗動物房籠養1周后進行實驗，每組10只小鼠。

1.2實驗方法

1.2.1建立γδ敲基因再回輸γδT細胞小鼠模型 取與γδ敲基因小鼠的同品系野生型C57小鼠，麻醉后浸泡于75%乙醇中10 min，置于無菌操作臺，開腹后剪取小腸置于無菌PBS液中，徹底清除腸道內容物，剪成0.5 cm小段后放入預先配制的消化液中(RPMI-1640液中加入1 mmol/L二硫蘇糖醇、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，265 r/min,37 ℃震蕩消化30 min。消化后200目過濾，取懸液1 500 r/min離心5 min，PBS清洗1遍后，取細胞沉淀于70% Percoll混勻，上層緩慢加入40%Percoll，1 360 r/min離心20 min(Eppendorf Centrifuge 5424離心機)，分界面周圍的細胞即為腸上皮內淋巴細胞。

取腸上皮內淋巴細胞用含鈣、10% 胎牛血清(FBS)、500 U/mL青霉素和鏈霉素及1 μL/mL非必需氨基酸的RPMI-1640培養基培養(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，并以2 μL/mL Con A、1 μL/mL PMA、100 μL/mL IL-2(美國R&D公司)及1 mmol/L的唑來膦酸(美國Sigma公司)刺激，分別于1、7、14、21、28 d經流式細胞技術(美國Applied Biosystems公司)檢測其γδT細胞含量。取經過刺激培養，且純度較高的γδT細胞尾靜脈回輸給γδ敲除基因小鼠，每只小鼠輸注5×106個γδT細胞。

1.2.2建立胰島移植模型

1.2.2.1建立Ⅰ型糖尿病模型 各組小鼠禁食12 h，尾尖取血測空腹血糖(德國羅氏公司)。一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液150 mg/kg,72 h后測空腹血糖，空腹血糖連續2 d高于16.7 mmol/L，且出現明顯多飲、多食和多尿癥狀，說明造模成功[4]。造模后每天更換小鼠墊料，保持環境干燥清潔。

1.2.2.2分離純化胰島細胞 Bablc小鼠，術前禁食12 h；用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后固定四肢成仰臥位，腹部備皮消毒，行V字型切開腹腔，充分暴露膽總管和胰管；用1號絲線結扎近十二指腸端膽總管，結扎時緊貼十二指腸壁；破心放血；在膽總管近肝門端用31G靜脈穿刺針灌注冷的0.5 mg/mL V型膠原酶(美國Sigma公司)2～3 mL，使胰腺充分膨脹；迅速摘取整個胰腺移入預置2 mL膠原酶的50 mL三角燒瓶中，放入38 ℃恒溫水浴鍋中靜止消化；消化25 min后取出燒瓶，震蕩使胰腺組織充分分散，成泥沙狀；加入4 ℃含10%胎牛血清的Hanks液20 mL終止消化，用50目不銹鋼網過濾，去除未消化的組織；將濾過的細胞懸液移入50 mL離心管中4 ℃，1 000 r/min離心2 min，去上清后重復離心1次；將分離好的胰島組織沉淀用Histopaque-1077分離液混懸，上層加RPMI-1640培養基，2 000 r/min離心20 min(緩慢加速，減速)后吸取分界面的胰島細胞，用4 ℃Hanks液離心洗滌2次備用；用雙硫腙(DTZ)染液1∶10與所得胰島混合10 min后鏡下觀察，直徑50～150 μm，呈猩紅色的細胞即為胰島細胞[5]。

1.2.2.3胰島移植 挑取直徑大于100 μm的胰島300～400個(圖1)，低速離心后加入PE50軟管內備用。取受體小鼠麻醉，左肋下開腹，充分暴露左腎，于腎下極包膜處剪開一長約0.3 cm切口。PE50管插入腎包膜約1 cm，緩慢注入，同時緩慢退出軟管，為胰島創造空間(圖2)。移植后分別于1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 d測量空腹血糖，并于術后兩周取移植物觀察病理情況。

圖1 胰島細胞團

圖2 胰島移植

1.3觀察指標 (1)小鼠小腸γδT細胞體外刺激培養前后流式細胞技術檢測；(2)血糖值：每天剪取小鼠尾部血管少許血液檢測血糖；(3)存活時間：從建立糖尿病模型后開始到小鼠死亡，記錄為存活時間；(4)病理檢查：移植后兩周取腎，HE染色后在顯微鏡下讀片。

2 結 果

2.1小鼠小腸γδT細胞體外刺激培養前后流式細胞技術檢測結果 野生型C57小鼠分離純化γδT細胞，初步比例約占25%(圖3)。通過進一步刺激培養，28 d后流式細胞儀鑒定可獲得純度約60%的γδT細胞(圖4)，并靜脈回輸至γδ敲基因小鼠體內建立γδ敲基因回輸γδT細胞小鼠。

圖3 初步分離純化后所得γδT細胞流式圖

圖4 培養刺激后所得γδT細胞流式圖

2.2Ⅰ型糖尿病小鼠造模及移植后存活情況 各組小鼠建立Ⅰ型糖尿病小鼠均達到10只，造模過程中野生型小鼠組出現1只因血糖過高死亡，其余兩組均有2只因感染死亡。野生型小鼠組存活時間(27±2)d和γδ敲基因再回輸小鼠組存活時間(24±1)d長于γδ敲基因小鼠(17±3)d，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3血糖值 圖中野生型小鼠組在(24±2)d移植物基本被排斥，γδ敲基因小鼠靜脈再回輸γδT細胞小鼠組在(21±1)d基本被排斥，γδ敲基因型小鼠組在(14±2)d基本被排斥。野生型小鼠組和γδ敲基因再回輸小鼠組血糖升高明顯慢于γδ敲基因型小鼠組，差異有統計學意義(P<0.05)；而野生型小鼠組和γδ敲基因再回輸小鼠組血糖變化無明顯差異(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠胰島移植后血糖變化曲線

圖6 野生型C57小鼠移植物病理(HE×200)

圖7 γδ敲基因小鼠移植物病理(HE×200)

圖8 γδ敲基因再回輸型小鼠移植物病理(HE×200)

2.4病理檢查 觀察移植物移植2周后細胞形態的完整性，圖中HE染色，腎組織外藍色細胞即為小鼠胰島細胞。顯微鏡下結果顯示宿主野生型C57小鼠腎包膜內的胰島細胞形態規整(圖6)，γδ敲基因再回輸小鼠組胰島細胞數量較多，但形態有一定程度的破壞(圖8)，而γδ敲基因小鼠胰島細胞數量少，且形態不規則(圖7)。

3 討 論

糖尿病是一種嚴重影響人類生活質量的慢性病，其患病率近年來不斷上升，目前的治療方法，如胰島素治療，只能控制病情進展，不能根治此類疾病[6-8]。而胰島移植是一種有望徹底根治糖尿病，特別是Ⅰ型糖尿病的治療方法。但是同種異體胰島移植后產生的免疫排斥反應，導致移植后胰島細胞凋亡，是影響胰島移植成功率的最大障礙。Albert大學進行的65例胰島移植患者在應用常規藥物進行移植后免疫抑制時發現，胰島移植相對于其他臟器移植有更大比例的患者因出現更復雜且更嚴重的不良反應而聯用更多種類的藥物，甚至停用免疫抑制劑，最后導致移植物丟失。因此，如何誘導并維持免疫耐受是一個急需解決的難題，目前誘導和維持免疫耐受的方法很多，如特異性全血輸注，脾細胞或骨髓細胞輸注等方法[9-10]。但是由于操作難度大，流程復雜，效率低和不良反應大等原因而不能在臨床推廣。在免疫耐受的機制中，γδT細胞起著非常重要的作用。γδT細胞激活后既可以誘導抗原特異性Treg 細胞增殖，還可以分泌大量的IL-10、TGF-β及巨噬細胞移動抑制因子等抑制性細胞因子。現有大量文獻證明Treg是機體維持自身耐受的重要組成部分，其在治療胰島移植排斥反應中起著誘導同種移植耐受和維持自身耐受的雙重作用[11-12]。IL-10和TGF-β作為抑制性細胞因子，是γδT細胞和Treg發揮作用的直接效應分子。這說明通過激活γδT細胞、擴增Treg并分泌IL-10和TGF-B等細胞因子，可以抑制免疫排斥反應。

本研究中，野生型糖尿病小鼠和γδ敲基因再回輸γδT細胞型糖尿病小鼠移植后血糖很快恢復正常，且能保持3周處于正常水平，并且術后存活時間更長，而γδ敲基因型糖尿病小鼠移植后2周血糖即重新升高到糖尿病水平。病理結果同樣提示移植2周后，野生型糖尿病小鼠和γδ敲基因再回輸γδT細胞型糖尿病小鼠腎包膜下仍然有大量形態較規則的胰島細胞團，而γδ敲基因型糖尿病小鼠腎包膜下只有少量且形態模糊的胰島細胞團。說明γδT細胞在胰島移植后保持移植物存活，維持血糖正常中起著重要作用，對在胰島移植中尋找誘導免疫耐受提供了一種新的思路，為進一步研究γδT細胞在胰島移植誘導免疫耐受中的作用機制及信號靶點奠定了基礎。

盡管胰島移植能治愈糖尿病，且其原理已明確，但是關于移植的時機、具體的量效關系、宿主遺傳背景及年齡等具體因素還需要進一步研究[13]。同時，移植后如何長期維持移植物活性的具體方案還不成熟。不過隨著γδT細胞誘導免疫耐受研究的不斷深入，胰島移植治療糖尿病的應用前景將很廣闊。

[1]衛國紅，蔡德鴻，翁建平.埃德蒙頓方案后的同種異體人胰島移植進展[J].中華糖尿病雜志，2005,13(6):475-477.

[2]POZZILLI P,MADDALONI E,BUZZETTI R.Combination immunotherapies for type 1 diabetes mellitus[J].Nat Rev Endocrinol,2015,11(5):289-297.

[3]劉長青，宋立江，蔣東升,等.不同種屬和禁食時間對鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型的影響研究[J].實用預防醫學,2010,17(2):377-378.

[4]程愈，申晶，郝好杰，等.單次大劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型β細胞凋亡的研究及意義探討[J].解放軍醫學學報,2013,34(7):756-759.

[5]肖芳，李文娟，侯新國,等.大鼠胰島分離及純化方案的改進[J].山東大學學報,2012,50(3):8-11.

[6]COGGER K,NOSTRO M C.Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes[J].Endocrinology,2015,156(1):8-15.

[7]JIANG Y,GAO H,KRANTZ A M,et al.Reduced GABAergic inhibition of kidney-related PVN neurons in streptozotocin-treated type 1 diabetic mouse[J].J Neurophysiol,2013,110(9):2192-2202.

[8]ZMUDA E J,POWELL C A,HAI T.A Method for murine islet isolation and subcapsular kidney[J].Transplantation J,2011,3(14):2096.

[9]GANGEMI A,SALEHI P,HATIPOGLU B,et al.Islet transplantation for brittle type 1 diabetes:the UIC protocol[J].Am J Transplant,2008,8(6):2650-1261.

[10]HU M J,RUAN G P,YAO X,et al.Induced autologous stem cell transplantation for treatment of rabbit type 1 diabetes[J].Cell Biol Int,2013,37(6):624-632.

[11]CHEN W,PERRUCHE S,LI J.CD4+CD25+T regulatory cells and TGF-beta in mucosal immune system:the good and the bad[J].Curr Med Chem,2007,14(21):2245-2249.

[12]JING H Z,CHAO Q L,SU J G,et al.Inhaled inactivated-Mycobacterium phlei modulates γ δ T cell function and alleviates airway inflammation in a mouse model of asthma[J].Asian Pac J Allergy Immunol,2013,31(4):286-291.

[13]ASHTON-CHESS J,GIRAL M,SOULILLOU J P,et al.Using biomarkers of tolerance and rejection to identify high- and low-risk patients following kidney transplantation[J].Transplantation,2009,87(9 Suppl):S95-99.