含HOE642的新型器官保存液對離體兔肺移植供肺細胞凋亡的影響*

余得水，龔添慶，周文琴，鄭劍橋，劉 斌△

(1.四川省宜賓市第二人民麻醉科 644000；2.四川大學華西醫院麻醉科，成都 610068)

如何減輕缺血再灌注肺損傷是目前肺移植研究中迫切需要解決的臨床問題[1]。以低鉀葡聚糖(low potassium dextran,LPD)液為代表的細胞外液型供肺保存液在肺移植后早期肺功能保護方面已表現出極大優勢[2]。在現有LPD液基礎上，有針對性地加入某些具有保護作用的活性物質，以提高供肺保存效果是目前肺保護研究熱點[3]。本課題組前期研究證實1型鈉氫通道(Na+-H+Exchangers 1，NHE1)特異性抑制劑HOE642能夠減輕兔離體心肌的缺血再灌注損傷[4]。因此，本實驗擬比較含HOE642的新型器官保存液與LPD液對肺移植供肺細胞凋亡的影響，以深入探討新型器官保存液減輕供肺缺血再灌注損傷的具體機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔24只，體質量2.0～2.5 kg，購自四川大學實驗動物中心[SCXK(川)2009-09]。

1.1.2試劑與儀器 HOE642由德國Aventis Pham公司惠贈；原位末端凋亡(TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司,美國)；單克隆Fas/Fas-L一抗，兔多克隆Bcl-2/Bax一抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(Sigma公司，美國)；單克隆抗體β-actin(Santa Cruz公司，美國);多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(Image-Pro Plus,Media Cybernetics,美國)。

1.2方法

1.2.1新型器官保存液的制備 將固體粉末型NHE1特異性抑制劑HOE642溶于含有已配制好的LPD液的容量瓶中，調整HOE642的濃度為50 μmol/L，玻璃棒充分攪拌30 min，使固體溶劑充分溶解。用氫氧化鈉(NaOH)調整pH值至7.2～7.6，并用50 μm微孔過濾器濾去不溶殘渣，便得到無菌的新型器官保存灌洗液，密封后放于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.2動物分組 24只成年雄性新西蘭大白兔分2組，LPD液組(LPD組)和新型器官保存液組(HOE組)，每組12只，每次實驗需要2只，分別作為肺移植的供體兔和受體兔。LPD組和HOE組供體兔心跳停止后，取出心肺聯合體，結扎右側肺門，分別用常規的LPD液和含有HOE642的新型器官灌洗保存液對左肺進行順行灌洗。

1.2.3動物模型制備及處理 受體兔麻醉開胸，全身肝素化，右側頸內靜脈置入5Fr中心靜脈導管至右心房，左側頸總動脈置入5Fr中心靜脈導管至主動脈弓。游離心肺組織后結扎左側肺門，分別將右頸內靜脈導管和左頸總動脈導管與已用膠體液預充的體外循環機相連。取出供肺，將其妥善固定于灌注裝置內，于再灌注開始前通過呼吸機進行機械通氣，吸入40%氧氣，潮氣量為8 mL/kg，呼吸頻率40次/分。在體外循環泵的作用下從受體兔右頸內靜脈引流出的靜脈血以40 mL/min的速度經供體的肺動脈導管進入供體左肺進行氧合。氧合后的血液通過肺靜脈經心尖部的引流管流出，在體外循環泵的推動下進入受體兔左頸總動脈導管，泵入受體兔體內，這樣形成了一個離體肺移植模型。在整個再灌注過程中，通過調節左頸內靜脈的引流速度，使受體兔動脈血壓維持于80～100/50～70 mm Hg，以穩定受體兔的整個血容量。通過恒溫水浴系統，將體外循環管路內血液溫度維持在37 ℃左右。待體外循環(再灌注)建立成功且循環穩定再灌注2 h后，用5 mL 10%氯化鉀(KCl)將受體兔處死，并留取供體肺組織標本。

1.2.4供體肺細胞凋亡指數(apoptosis index,AI)檢測 剪取供肺中下葉背側面約0.5 cm3的肺組織，迅速將其放入10%甲醛液中固定24 h后進行病理切片制作。石蠟標本的制作：無水乙醇對標本進行梯度脫水處理后，二甲苯、二甲苯-石蠟及石蠟依次浸泡標本。將標本置入熔融的石蠟中浸透，包埋。對包埋好的石蠟標本進行切片，厚度為5 μm。乙醇對標本進行梯度水化，用蛋白酶K室溫孵育15～30 min，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗2次。標本滴加50 μL的TUNEL反應混合溶液，在濕盒中37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，熒光鏡下分析結果。TUNEL染色后的陽性細胞表現為細胞核呈黃棕色著染，而部分也可因DNA碎片逸出細胞核而呈現較淺的陽性著色。每張切片在400倍光鏡下隨機選擇10個視野進行觀察和計數，將整個視野中的陽性細胞(凋亡細胞)占總的細胞數的百分比作為凋亡指數(AI)，AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5肺組織中凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)的測定 取肺組織塊，用4%多聚甲醛進行固定，乙醇梯度脫水后石蠟包埋、切片；將厚度3～5 μm的組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，脫蠟、入水沖洗。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min。切片上滴加一抗，4 ℃過夜，切片上滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃孵育20 min，切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗后脫水、中性樹脂封片。顯微鏡觀察：兩組進行100倍和400倍的顯微照相。染色后的陽性細胞表現為細胞質和細胞核呈黃褐色著染。每張切片在400倍光鏡下隨機選擇5個視野進行觀察,對整個視野中的陽性細胞進行計數。

1.2.6肺組織中Fas/FasL和Bcl-2/Bax蛋白水平的檢測 剪取供肺中下葉背側面約0.5 cm3的肺組織，清理干凈表面血跡及附著物，用電子天平稱量后按質量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿。將該組織勻漿進行離心，離心速度3 000 r/min，10 min。離心后取組織勻漿上清液再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿待測。由-80 ℃冰箱取出提取的總蛋白標本，冰中融化；制備分離膠，濃縮膠，上樣，電泳。凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物上，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測，用Image J軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1供體肺細胞AI及凋亡蛋白caspase-3的表達 HOE組只有少量細胞的細胞核出現了黃棕色著染，而 LPD組供肺組織中細胞核呈現黃棕色的細胞數量明顯增加，并且LPD組中呈TUNEL陽性反應的細胞主要是Ⅱ型肺泡上皮細胞和血管內皮細胞,見圖1。HEO組的AI明顯小于LPD組(P<0.05)。HOE組中caspase-3陽性細胞數明顯低于LPD組(P<0.05)，見圖2、表1。

圖1 TUNEL染色后兩組細胞凋亡檢測結果(×400)

圖2 兩組caspase-3 表達檢測結果(×400)

組別AI(%)caspase-3陽性細胞數(個)LPD組13.06±0.7131.75±8.33HOE組4.57±0.93a16.83±7.98a

a:P<0.05,與LPD組比較

2.2肺組織中Fas/FasL和Bcl-2/Bax蛋白水平的表達變化 與LPD組比較，HOE組Fas和FasL的表達均明顯降低(P<0.05)；HOE組Bcl-2蛋白表達增加而Bax蛋白的表達降低，兩者的比值(Bcl-2/Bax)較LPD組明顯升高(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 兩組Fas/Fas-L、Bcl-2/Bax蛋白表達檢測

組別FasFas-LBaxBcl-2LPD組1.45±0.211.27±0.331.32±0.330.76±0.21HOE組1.14±0.28a0.88±0.26a0.96±0.26a1.33±0.23a

a:P<0.05,與LPD組比較

3 討 論

目前衡量肺移植后肺缺血再灌注損傷程度的指標主要是肺功能的本身和肺的組織病理學改變，而對肺組織細胞凋亡的研究相對較少[5]。研究表明缺血再灌注損傷所引發的凋亡細胞與供肺的分流指數及細胞的氧化損傷程度呈正相關[6]。特別是在再灌注的早期，細胞凋亡與動脈血氧分壓、肺組織病理學改變及肺組織的含水量變化趨勢一致[7]。

本研究顯示，HOE組供肺離體灌注2 h后其AI明顯低于LPD組，凋亡蛋白caspase-3的表達也顯著降低。再灌注帶來的大量細胞凋亡使得存活的、有功能的肺泡上皮細胞的細胞總數下降。這導致呼吸膜的結構完整性受到破壞，肺表面活性物質的分泌減少，最終發生肺不張及肺水腫影響肺的換氣功能[8]。因此，細胞凋亡直接參與了肺移植過程中的缺血再灌注肺損傷，是移植后肺功能損傷程度的一個重要指標。

本研究發現外源性凋亡途徑的特征性蛋白Fas和Fas-L在HOE組肺組織中僅有少量表達，而在LPD組中表達明顯上調。肺的缺血再灌注損傷可使得肺組織及肺動脈上皮細胞Fas/Fas-L的表達增加，而通過給予Fas-L抗體的方式消耗Fas則可以明顯的減輕細胞凋亡[9]。另一方面，HOE組供肺組織的Bcl-2蛋白的表達明顯高于LPD組，同時Bax蛋白的表達又明顯低于LPD組。多個研究證實Bcl-2在供體移植物中的過度表達具有抗凋亡的細胞保護作用。而促凋亡基因Bax則是通過對抗Bcl-2蛋白的抗凋亡作用發揮效應的。Bcl-2與Bax的比值越高，說明細胞中抗凋亡因子作用較強；反之，則說明細胞中正在或是即將發生凋亡[10]。本研究顯示HOE組供肺細胞仍然處于相對抗凋亡狀態，而LPD組供肺細胞內源性凋亡途徑正處于活躍狀態，正在執行細胞凋亡的指令，誘發細胞凋亡。

NHE1廣泛分布于肺泡細胞，特別是Ⅱ型肺泡上皮細胞表面。在缺血缺氧細胞內氫離子水平增加出現酸中毒時，NHE1通道被激活，通過H+-Na+- Ca2+等電位交換的方式使得大量的細胞外Ca2+進入細胞內形成了鈣超載，而細胞內Ca2+濃度升高可能是調控凋亡起始的主動因素之一[11]。本研究的前期研究結果顯示，與LPD液相比，該新型器官保存液能大幅降低細胞內鈣離子濃度[12]。因此，HOE642通過特異性抑制NHE1，使得細胞內Ca2+水平升高沒有超過線粒體的緩沖能力，無法大規模激活細胞內、外源性凋亡通路，導致細胞凋亡較少。

本研究選擇再灌注2 h作為時間點檢測細胞凋亡情況是因為在犬、大鼠及人類的同種單肺移植過程中，再灌注2 h后供肺細胞的AI達到一個頂峰。其機制可能是因為凋亡是程序性的細胞死亡，并且是一個主動的耗能過程，在短時間的冷凍保存過程中，細胞缺乏能量轉換而無法執行凋亡指令，再灌注開始后能量供給正常細胞隨即開始凋亡進程；如果冷保存時間過長，細胞在長時間的冷缺血過程中已經開始死亡，即使再灌注后細胞也只能發生壞死而不是凋亡[13]。

綜上所述，本研究證實含HOE642的新型器官保存液能通過抑制細胞內、外源性凋亡通路相關蛋白的表達，從而最終減少細胞凋亡，減輕供肺的缺血再灌注損傷。

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