p53、p21在氟中毒雌鼠卵巢早衰中的表達變化*

劉 洋，李艷菊，王 寧，劉振華，楊 華，劉燕青，王飛清△

(1.貴陽中醫學院第一附屬醫院檢驗科，貴陽 550001；2.貴州醫科大學附屬醫院血液科，貴陽 550004；3.貴州省骨科醫院藥劑科，貴陽 550002；4.貴州省人民醫院肝膽外科，貴陽 550002)

研究顯示，過量氟可導致機體氧化應激產物大量蓄積進一步損傷子宮、卵巢等生殖臟器[1-2]。當前，氟中毒對雌性機體損傷和防治是科研人員的難題，本課題組前期研究發現燃煤型氟中毒可影響雌鼠動情周期、性激素分泌、損傷卵巢超微結構[3-5]。實驗報道，p53和p21在失重致雌鼠卵巢衰老中呈現高表達[6]。氟中毒是否通過激活衰老基因p53和p21的表達，促進卵巢過早衰老，影響雌性生殖功能的相關機制研究還未得到科研人員的關注。本課題組設計以SD雌鼠為研究對象，解析燃煤型氟中毒致雌鼠卵巢早衰影響因子，并為今后病區雌性生殖功能的防治工作起到重要意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 由貴州醫科大學動物實驗中心提供90～100 g清潔級SD大鼠24只，許可證號：SCXK(黔)2012-0001。實時定量熒光PCR(RT-PCR)由大連寶生物公司提供；引物序列primer3設計由上海英俊公司合成；PF-1型氟離子選擇性電極由上海精密科學儀器有限公司生產；Olympus BX51雙目光學顯微鏡由奧林巴斯光學工業株式會社生產。

1.2方法

1.2.1動物模型構建 適應性喂養1周，分為對照組、低氟組(25 mg/kg)、中氟組(50 mg/kg)、高氟組(100 mg/kg)，每組6只，每周調整鼠籠的位置，力求各組雌鼠的實驗條件一致。各組自由飲水，自由食用不同配方的原煤加拌泥煤烘烤的玉米飼料，于染氟90 d處死。

1.2.2氟斑牙發生情況 每周觀察各組大鼠牙齒變化情況，并判定大鼠牙齒的損傷程度并記錄。處死大鼠前對各大鼠的牙齒進行拍照。具體氟斑牙分度參考國家標準分為正常、輕度、中度、重度[7]。

1.2.3尿氟和骨氟 采用氟離子選擇電極法測定氟水平，具體參見既往實驗[4]。

1.2.4光鏡觀察卵巢組織形態學變化 處死動物后，迅速取下一側卵巢，經10%甲醛溶液固定3 d后，常規取材、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡200倍鏡下觀察卵巢組織結構有無形態學改變。

1.2.5RT-PCR測定卵巢中p53、p21 mRNA表達 采用Trizol法提取雌鼠卵巢組織總RNA，根據試劑盒說明書具體方法進一步采用RT-PCR進行基因片段擴增并定量。各PCR反應管中所加模板RNA的量約為1 μg。p53、p21 PCR擴增條件為：RT-PCR 95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。Melt curve 95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，60個循環。結果通過RT-PCR儀記錄的Ct值對起始模板相對定量分析。

2 結 果

2.1氟斑牙發生情況 對照組均無氟斑牙出現，各染氟組隨染氟劑量的升高，均出現不同程度的氟斑牙，數量分為(正常、輕度、中度、重度)：低氟組(2、4、0、0)、中氟組(0、3、3、0)、高氟組(0、0、2、4)，且氟斑牙癥狀呈逐漸加重趨勢，見圖1。

A：對照組牙齒；B：輕度氟斑牙；C：中度氟斑牙；D：重度氟斑牙

圖1各組氟斑牙發生情況

2.2尿氟和骨氟情況 含氟量飼料攝入增加，尿氟水平逐漸升高，中氟組和高氟組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。各染氟組組間比較，尿氟水平逐漸升高，高氟組與各組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。含氟量飼料攝入增加，骨氟水平逐漸升高，各染氟組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，各染氟組組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 尿氟和骨氟水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低氟組比較；c：P<0.05，與中氟組比較

2.3各組雌鼠卵巢HE染色形態 各組雌鼠卵巢外觀色澤鮮紅，光鏡下對照組卵巢組織結構形態正常，可見不同發育階段的卵泡，顆粒細胞排列整齊。各染氟組卵巢間質正常，未見間質出血、水腫、間質纖維增生、組織變性壞死、炎性細胞浸潤等組織形態異常。低氟組卵巢組織未見早衰，但染氟組隨染氟劑量的增加，卵巢組織顆粒細胞水腫趨勢加重，組織細胞形態損傷模糊，且閉鎖的卵泡明顯增加，黃體退化嚴重，成熟卵泡顯著減少，卵巢呈現早衰跡象，見圖2。

A：對照組；B：低氟組；C：中氟組；D：重氟組

圖2各組卵巢形態情況(×200)

2.4各組雌鼠卵巢組織p53和p21表達結果 與對照組比較，低氟組p21增高，但差異無統計學意義(P>0.05)，其他各染氟組p53和p21比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；各染氟組組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組p53和p21表達

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低氟組比較；c：P<0.05，與中氟組比較

3 討 論

圍繞燃煤型氟中毒這種地域性強、病區廣、危害高、防治難的地方病一直是貴州省醫療領域長期重點攻關課題[8-9]。卵泡是卵巢的主要功能單位，卵巢實質內有許多不同發育時期的卵泡，且呈月周期變化[10]。GUNEY等[1]報道氟中毒可引發女性生殖系統功能的改變，對其性成熟、受孕及生殖器官的老化均有影響。流行病學調查顯示高氟區女性月經初潮年齡較正常女性明顯延遲，最長可相差2～3年。本實驗HE染色結果發現，隨染氟劑量的增加，卵巢組織顆粒細胞呈現輕度、中度、重度水腫的趨勢，細胞形態損傷模糊，且閉鎖的卵泡明顯增加，黃體退化嚴重，成熟卵泡顯著減少，導致卵巢儲備下降并呈現早衰的跡象。

隨著對地氟病損傷分子機制的不斷深入研究，近年來氟中毒對女性卵巢生殖系統的影響逐漸引起重視。研究表明p53和p21表達情況受不同途徑刺激有關，增加p53表達上調p21表達，這與細胞分裂周期、衰老和凋亡密切相關[11-13]。在p53的下游基因中，p21是p53執行激活細胞衰老的下游靶基因已為共識[14]。本課題組前期研究發現，p53和p21基因可調控骨髓間充質干細胞和心肌細胞衰老的作用[15-16]。LIU等[17]發現p53和p21表達增高促進卵巢顆粒細胞凋亡在雷公藤致卵巢早衰中起主導作用。本實驗結果顯示，隨著染氟劑量增加，卵巢組織中p53和p21表達逐漸增高，提示燃煤型氟中毒可促進卵巢組織p53和p21表達。研究證實氟中毒對機體損傷主要是氧化應激產物的蓄積，由此推測燃煤型氟中毒導致雌鼠卵巢早衰可能是通過機體氧化應激產物蓄積，從而激活p53表達，進一步激活下游p21表達，促進卵泡閉鎖，加速卵巢衰老，這與光鏡卵巢HE染色結果相一致。

綜上所述，燃煤型氟中毒可明顯損傷卵巢組織，促進卵泡閉鎖，且卵巢組織中衰老基因p53和p21表達增高，導致卵巢早衰，影響卵巢儲備能力，因此控制氟的攝入是防治地氟病對機體損傷的有效方式。本實驗還補充氟中毒對雌性生殖系統早衰的空白，對進一步為我國氟中毒災區女性生殖健康預防提供相關數據，為防治氟中毒有重要意義。

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