HPC2蛋白在HPV16感染的宮頸癌細胞中調控作用初探*

劉 玲，杜海虹，范凌曄，聶 丹，毛熙光△

(1.西南醫科大學附屬醫院婦產科，四川瀘州 646000；2.四川省眉山市人民醫院產科 620010)

宮頸癌是全球排名第3的婦女惡性腫瘤[1]，人乳頭瘤病毒(HPV)感染宮頸后，病毒基因整合到人宮頸上皮細胞，與其他促癌因素共同作用促成癌癥的發生。E7基因是HPV的主要致癌基因之一，其編碼的E7蛋白可使細胞周期失控而發生永生化。人多梳蛋白2 (HPC2)即染色盒同源物4(chrombox homolog 4,CBX4)，在腫瘤細胞株和組織中表達上調，CBX4過表達與腫瘤分期和惡性程度密切相關[2]，HPC2對靶基因的抑制作用的異常可能導致宮頸癌的發生[3]。為探索HPC2與宮頸癌發生的機制，本課題組研究了HPC2與HPV16的原癌基因E7之間的關系及其對細胞增殖、凋亡的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 siha細胞(由西南醫科大學附屬醫院中心實驗室惠贈)；Trizol、RNA提取試劑盒和cDNA試劑盒(北京天根生物科技有限公司)，HPC2 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)，HPV16E7 siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)，lipofectamine 2000 reagent(美國Invitrogen公司)，CBX4兔抗單克隆抗體(英國Abcam公司)，β-actin兔抗單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，膜聯蛋白V標記的異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將siha細胞分為4個組：空白對照組、NControl siRNA組(對照組)、HPC2 siRNA組和HPV16E7 siRNA組。空白對照組為未轉染任何序列RNA組，NControl siRNA組為轉染陰性序列對照組，HPC2 siRNA組為沉默HPC2組，HPV16E7 siRNA組為沉默HPV16E7組。

1.2.2細胞轉染 每個6孔培養板中接種4×105個對數生長期的siha細胞，培養24 h，細胞融合達到60%時開始實驗。操作步驟按照美國Invitrogen公司提供的操作說明。倒置熒光顯微鏡下觀察轉染24 h后NControl siRNA-CY3轉染組紅色熒光情況。HPC2 siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司合成)，靶序列：5′-GGT AGA ATG TCC AGA TGA A-3′，正義鏈：5′-GGU AGA AUG UCC AGA UGA AdTdT-3′，反義鏈:3′-dTdTC CAU CUU ACA GGU CUA CUU-5′。HPV16E7 siRNA(上海吉瑪公司合成)，5′-GGA CAG AGC CCA UUA CAA UTT AUU GUA AUG GGC UCU GUC CTT-3′。

1.2.3熒光定量PCR 提取細胞總RNA參照北京天根公司提供的說明書操作，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列：上游5′-CCC CAT ACA CAG TGT TAG CC-3′，下游5′-GAG TGA TTT TCC CGT CC-3′；HPC2引物序列：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；HPV16E7引物序列：上游5′-TGC AAC CAG CAA CTG AT-3′，下游5′-TGC AAC CAG CAA CTG AT-3′。DNA擴增條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環35次；終延伸72 ℃ 5 min。熒光定量PCR反應條件為96 ℃預變性5 min；96 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30，循環40次；終延伸72 ℃ 10 min。每組設3個復孔，記錄Ct值，取平均值。△Ct值=目的基因Ct值-內參基因的Ct 值；△△Ct值=實驗組基因的△Ct值-空白對照組基因的△Ct 值；2-△△Ct值=實驗組基因/空白組基因(倍數)。

1.2.4Western blot 提取總蛋白并測其濃度，制膠，正丁醇封閉20～30 min，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，置于搖床上搖2 h，封閉液稀釋一抗HPC2(1∶400)、β-actin(1∶1 000)孵育；封閉液稀釋兔二抗(1∶1 000)孵育。化學發光后凝膠成像系統成像，保存圖片。

1.2.5CCK-8試驗 每組設5個復孔，將96孔板放細胞培養箱24 h后轉染siRNA，細胞轉染1～7 d時間點每孔加入10 μL CCK-8 溶液，放進細胞培養箱繼續培養，于2 h時間點用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD)。

1.2.6流式細胞技術 siha細胞接種于25 cm2細胞培養瓶，24 h后行細胞轉染，轉染48 h收集細胞，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入195 μL 結合緩沖液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫孵育15 min；離心后棄上清液，加入190 μL Annexin V-FITC 結合緩沖液輕輕重懸細胞，10 μL碘化丙啶(PI)溶液，輕輕混勻，避光室溫放置20 min，冰浴；上機檢測。

2 結 果

2.1siha細胞HPV16E7基因沉默后HPC2基因的表達 siha細胞轉染HPV16E7 siRNA 48 h后，HPC2 mRNA表達水平較對照組下調75%左右，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

a:P<0.01。

圖1 3組HPC2 mRNA(2-△△Ct值柱狀圖)在siha細胞中的表達

2.2HPV16E7基因抑制后對siha細胞中HPC2蛋白表達的影響 siha細胞轉染HPV16E7 siRNA 48 h后，HPC2蛋白水平下調，與HPC2 siRNA轉染效果相當，見圖2。

1，4:空白對照組；2,5：對照；3：HPC2 siRNA組；6：HPV16E7 siRNA組

圖2 6組HPC2蛋白在siha細胞中的表達

2.3HPC2基因抑制后對siha細胞增殖的影響 隨著時間延長，OD值逐漸增加。與其他各組細胞相比，轉染HPC2 siRNA的siha 細胞OD值自第3天開始增幅降低，第7天各組細胞OD值分別為：空白對照組2.08±0.07；對照組2.00±0.09；HPC2 siRNA組0.92±0.10。HPC2 siRNA組較對照組顯著降低(t=20.403，P<0.01)，見圖3。

ZC:空白對照組；NC:對照組；HPC2：HPC2 siRNA組

圖3 3組siha細胞OD值變化

2.4HPC2基因抑制后對siha細胞凋亡的影響 轉染48 h后，HPC2 siRNA組早期凋亡和晚期凋亡比例為6.38%，HPV16E7 siRNA組為7.03%，對照組為3.94%，空白對照組為0.21%；HPC2 siRNA組轉染后細胞凋亡比例較對照組增加2.44%，HPV16E7 siRNA組轉染后細胞凋亡比例較對照組增加3.09%，見圖4。

圖4 4組 siha細胞凋亡率

3 討 論

HPC2作為PcG家族重要成員，是基因轉錄抑制因子，與B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點-1(BMI-1)、RING1、HPH3 3種 PcG蛋白及非PcG蛋白C-末端結合蛋白(CtBP)和轉錄因子E2F相互作用形成HPC-HPH蛋白復合物來執行功能[4]。HPC2可能抑制原癌基因的轉錄而參與調控腫瘤形成、細胞凋亡及細胞周期等[5]。HPC2既是PcG蛋白又是SUMO E3連接酶，其可通過SUMO化修飾調節KDM5B活性，抑制細胞周期和DNA修復基因的表達[5]；CBX4通過募集HCAC3到RUNX2啟動子抑制RUNX2的表達[6]。人類癌細胞系和正常組織中HPC2的表達水平差異較大，在Burkitt淋巴瘤和肺癌中幾乎檢測不到HPC2轉錄子，而HPC2在其他細胞系中均呈高表達狀態[5]。HPC2基因突變或表達異常與腫瘤的發生可能存在密切聯系[7-8]，CBX4通過抑制RUNX2的表達抑制結腸癌的轉移[6,9]，CBX4 通過控制HIF-1α蛋白在腫瘤血管生成中起著關鍵作用,作為SUMO E3泛素連接酶促進肝癌的進展和轉移[7-8]，敲除CBX4導致了HIF-1α靶基因的下調表達,導致在常氧條件下骨肉瘤細胞生長和細胞存活率的顯著抑制[2]。既往研究證實PC家族中HPC2是惟一具有SUMO E3活性的成員[10]，在細胞干性、細胞衰老/胚胎發育、細胞周期、DNA損傷應答及腫瘤的發生等方面均有調控作用。

羧基端是HPC2蛋白發揮抑制功能必不可少的結構域，若其發生突變會導致其抑制靶基因轉錄的功能喪失。但其可與內源性的HPC2 蛋白競爭結合PcG蛋白反應元件，從而干擾正常內源性HPC2蛋白的功能。HPC2的SUMO化作用能改變蛋白構型，進而改變蛋白功能。有研究檢測到人宮頸癌HPC2基因的C端的保守序列的突變，其與轉錄抑制物CtBP結合的能力喪失，抑制靶基因轉錄的作用降低，細胞惡性分化，誘發宮頸癌[3]。以上文獻報道基于對HPC2結構水平上的研究，而本實驗從定量上探討HPC2與E7基因的關系，結果顯示：E7基因沉默后，HPC2無論是在基因水平還是在蛋白水平均呈現下調表達，推測E7蛋白可能調控PcG蛋白HPC2的表達。

Notch信號轉導途徑的變化與某些腫瘤的發生、發展密切相關。HPV相關蛋白E6/E7介導宮頸癌細胞Notch信號通路的異常上調，二者在維持腫瘤的生長及異型性有協同作用。此外，Fas蛋白家族介導Notch1抑制E6/E7的表達。Notch信號途徑參與了細胞增殖、凋亡與分化等過程，參與腫瘤的發生[11]。關鍵轉錄因子CBF-1/RBP-Jk介導了經典的Notch信號途徑，而HPC2參與了對RBP-Jk的調控[12]。本研究結果提示E7調控HPC2的表達，由此推測E7可能通過調控HPC2的表達來調控RBP-Jk介導的經典Notch通路，Notch通路的異常調控，最終導致宮頸癌的發生。本研究發現抑制HPC2與抑制E7基因后對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響相似，結合E7與HPC2基因之間的關系，推測E7基因可能通過調控HPC2來參與細胞的增殖凋亡過程，從而參與宮頸癌的發生。但其具體通過何種途徑何種機制來參與，還需要更進一步的研究來證實。

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