CXCL12、CXCR4、MVD在多發性骨髓瘤骨髓微龕中表達及意義*

周 俊，葉 麗，林凡莉，汪姝玥，李曉明，黃純蘭△

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬醫院血液內科，四川瀘州 646000)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)居血液系統惡性腫瘤第2位，目前仍是臨床無法治愈的疾病。MM以骨髓微龕中瘤型漿細胞克隆、增殖，血液、尿液中單克隆蛋白增多為主要特點，終末器官損害主要表現為貧血、腎功能不全、骨痛、高鈣血癥等[1-3]。趨化因子配體12(CXCL12)及趨化因子受體4(CXCR4)形成CXCL12/CXCR4生物軸在多種腫瘤中發現,能夠促進腫瘤細胞的生長,抑制腫瘤細胞的凋亡,促進腫瘤血管生成,影響某些腫瘤的靶向轉移,增強腫瘤細胞的黏附和遷移能力,影響腫瘤細胞的分泌行為等[4-7]，其在MM中的作用機制有待進一步研究，本研究通過測定MM患者骨髓活檢組織中CXCL12、CXCR4、微血管密度(microvessel density，MVD)的表達、分布，以研究其在MM中表達并對臨床意義進行討論，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月至2016年7月西南醫科大學附屬醫院血液科收治的MM患者63例作為試驗組，其中男34例，女29例，平均年齡(59.73±8.85)歲，MM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期42例，免疫球蛋白分型輕鏈型11例，IgG型33例，IgA型19例，血清輕鏈分型λ型26例，κ型37例。所有患者均符合中國MM診治指南(2015年修訂)中MM診斷標準[8]。選擇同期健康人42例作為對照組，其中男20例，女22例，平均年齡(60.20±13.37)歲。

1.2方法

1.2.1檢測方式 用免疫組織化學SP法，檢測試驗組、對照組骨髓活檢組織標本中CXCL12、CXCR4及MVD的表達。收集骨髓活檢組織蠟塊4 μm厚連續切片，依次行脫蠟水化、抗原修復、一抗、二抗孵育、二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木精復染、分化-封片、鏡檢、拍照。用已知陽性切片做陽性對照，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗做陰性對照。并收集兩組性別、年齡、臨床分期、免疫球蛋白、輕鏈分型臨床資料，將上述資料進行統計學相關分析。

1.2.2結果判定 骨髓組織細胞的細胞質和細胞膜內出現棕黃色著色顆粒為CXCL12和CXCR4陽性細胞，結果評價用SP法染色強度(陽性)和陽性細胞百分比確定。隨機觀察10個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞，根據其中陽性細胞所占百分比和染色強度分別進行評分，最后綜合評定結果。(1)陽性細胞所占百分比評分：<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。(2)染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，淡黃色至黃色為2分，黃色至棕黃色為3分。(3) 結果判斷：染色強度和陽性細胞分值之和為最終分值。總積分0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中強陽性(++)，6分及以上為強陽性(+++)。細胞質出現棕黃色著色顆粒為MVD陽性細胞，首先形態學觀察：在低倍光學顯微鏡下(×100)判斷骨髓病理切片的取材、染色是否成功，骨髓增生程度，微血管分布情況；高倍鏡下(×400)觀察內皮細胞、微血管形態，并進行微血管計數。骨髓MVD計數：對每張切片進行 MVD 計數。首先在低倍鏡下(×100)進行逐個視野的觀察，至少選出 3 個血管最豐富且不相連的熱點區域，然后在高倍鏡下(×400)計數微血管，共計數 3 次，取其平均值表示 MVD。任何呈棕黃色的能夠計數的血管，不以是否有管腔或管腔中是否有紅細胞作為判斷標準，骨小梁內或與骨小梁相連的血管被排除在外。

2 結 果

2.1CXCL12、CXCR4和MVD染色情況 CXCL12、CXCR4蛋白表達陽性染色位于骨髓細胞細胞質，染色顆粒呈淺黃色或棕黃色；MVD蛋白表達陽性染色位于細胞膜，見圖1～3。

A:對照組骨髓中細胞染色呈黃色，細胞散在表達，呈弱陽性；B:試驗組骨髓中細胞彌漫表達，呈棕黃色，呈強陽性

圖1兩組骨髓中CXCL12染色(×400)

A:對照組骨髓中細胞染色呈黃色，細胞散在表達，呈弱陽性；B:試驗組骨髓中細胞彌漫表達，呈棕黃色，呈強陽性

圖2兩組骨髓中CXCR4染色(×400)

A:對照組骨髓顯示微小血管形態規則，結構良好；B:試驗組骨髓顯示微血管明顯增多，微血管形態不規則，大小不一；C:試驗組骨髓可見單個內皮細胞，內皮細胞團簇，甚至成線狀排列未見明顯管腔

圖3 兩組骨髓中MVD染色(×400)

2.2CXCL12、CXCR4和MVD蛋白表達情況 試驗組骨髓CXCL12、CXCR4和MVD表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。MM患者骨髓CXCL12、CXCR4和MVD的表達與患者性別、年齡、免疫球蛋白、輕鏈分型表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3相關性分析結果 MM的骨髓CXCL12表達與CXCR4、MVD表達均呈正相關，見表1。

3 討 論

MM是骨髓中漿細胞呈惡性克隆的增殖性疾病，可累及骨髓、血液、腎臟等多個靶器官，骨髓微環境也受漿細胞影響發生相應變化。諸多學者就分子、因子等多方面對MM微環境改變、血管生成機制等進行研究[9-14]。

CXCL12又稱基質細胞衍生因子-1(SDF-1)，屬于CXC族趨化因子成員，對骨髓基質細胞、T淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等均有趨化作用，而這些細胞也都表達CXCR4。CXCR4是CXCL12的特異受體，是由352個氨基酸組成的G蛋白偶聯受體。CXCL12/CXCR4生物軸在調節腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移、血管生成中具有重要作用[15-19]。MM細胞可表達CXCR4，CXCL12 與 CXCR4 相互作用，趨化MM細胞的遷移和定居在骨髓微環境[20-21]。本研究試驗組CXCL12、CXCR4的表達較對照組明顯增加，與以上觀點相符合，CXCL12、CXCR4與MM的發生相關，因此推測CXCL12/CXCR4生物軸在MM發病機制中具有重要作用。此外，該生物軸與骨髓微環境中血管新生具有密切關系。CXCL12/CXCR4生物軸可通過促進血管內皮生長因子(VEGF)分泌促進血管生成[22-25]。既往多項研究表明血管新生與惡性血液病發生、演變、預后密切相關[26-27]。MM骨髓活檢中MVD明顯高于對照組，表明血管新生與MM的發生有明顯關系。腫瘤的發生、發展有賴于新生血管的形成，而CXCL12/CXCR4與血管新生過程密切相關[28]。在腫瘤缺氧環境下，由缺氧因子誘導，VEGF大量表達，CXCL12表達也明顯升高。ECONOMIDOU等[29]研究發現CXCL12/CXCR4在惡性胸腔積液中高度表達，并發現CXCL12與VEGF呈正相關，因此認為CXCL12上調VEGF的表達，促進血管新生。本研究表明，MM組骨髓CXCL12/CXCR4的表達與MVD的表達呈正相關，故推測MM骨髓微環境中CXCL12/CXCR4生物軸可促進血管新生，因此可認為抑制CXCL12/CXCR4在微血管形成的作用會成為抗腫瘤治療的新途徑。

綜上所述，骨髓微環境中血管新生機制可能成為治療MM的新靶點，通過抑制CXCL12/CXCR4生物軸抗血管新生可為MM的發病機制及尋找有效的診斷和治療提供新的途徑。

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