銅綠假單胞菌PA0745基因突變株的構建及鑒定

盧培林，劉 利，熊 霞

(西南醫科大學附屬醫院皮膚科，四川瀘州 646000)

銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性需氧菌，普遍存在于土壤、水、空氣和多種動物體內，具有較強的環境適應性和耐藥性，可引起泌尿系統、呼吸系統和消化系統感染等，是慢性皮膚潰瘍創面感染最常見的細菌。尤其在合并有基礎疾病或免疫力低下時，如患有艾滋病、糖尿病和癌癥等，病死率將大大增加。此外，由于銅綠假單胞菌耐藥性強、耐藥譜廣，對多種抗菌藥物表現出天然或獲得性耐藥，可供選擇的有效抗菌藥物很少。因此，從根本上尋找新的抗銅綠假單胞菌感染途徑具有重大意義[1-2]。

研究顯示，銅綠假單胞菌耐藥性的產生與生物膜的形成息息相關。其中，臨床分離的銅綠假單胞菌PA14細胞株可產生一種擴散信號分子(diffusible signal factor,DSF)類的小分子化合物順式-2-癸烯酸(cis-2-decenoic acid，CDA)，CDA可有效擴散PA14細胞株形成的生物膜，增強銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性。相關研究表明，烯酰輔酶A水合酶/異構酶是CDA合成過程的關鍵酶[3-6]。當PA0745基因功能受到抑制時，CDA合成受阻，銅綠假單胞菌菌膜擴散能力減弱，致病性下降。當外源性加入CDA時，菌膜運動能和細菌侵染力又得以恢復。另有研究表明，PA0745基因結構中有兩個保守的谷氨酸殘基對行使其催化功能具有重要意義，他們分別是α3上的Glu126和α4上的Glu146[7-9]。本研究利用同源重組的原理構建 PA0745基因點突變株E126A、E146A和基因缺失株ΔPA0745，通過生長曲線測定和細胞侵染實驗初步驗證了PA0745基因對銅綠假單胞菌致病性的影響。銅綠假單胞菌突變株的構建有助于開展銅綠假單胞菌功能組學研究和抗菌藥物的開發。

表1 銅綠假單胞菌PA14突變株構建所用引物表

up：上游；down：下游

1 材料與方法

1.1材料 大腸埃希菌DH5α感受態細胞購自北京天根生化科技有限公司，S17-1由四川大學包銳研究員惠贈，銅綠假單胞菌PA14細胞株和穿梭質粒PEX18Gm均由四川大學王震玲教授惠贈。其中，PEX18Gm質粒含有負選擇性標記基因SacB，含有慶大霉素(Gentamicin,Gm)抗性基因。

1.2主要試劑及引物 DNA聚合酶(Q5TMHot Start High-Fidelity DNA Polymerase)購自北京NEB公司，同源重組酶(ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit)購自南京Vazyme公司，磷酸化酶(Blunting Kination Ligation Kit)購自日本TaKaRa公司，限制性內切酶(Dpn Ⅰ)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，質粒提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，抗生素購自北京天根生化科技有限公司，蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司。引物合成和DNA測序由擎科生物科技有限公司完成，引物序列見表1。用Primer Priemier5.0軟件，根據銅綠假單胞菌PA14株染色體上PA0745基因上下游序列，設計包含其上下游同源臂序列(800 bp)的引物、點突變引物和PA0745基因敲除引物。

1.3方法

1.3.1重組質粒PEX0745(PEX18+PA0745-up+PA0745+PA0745-down)的構建[10]

1.3.1.1制備線性化載體PEX18Gm 以PEX18Gm質粒為模板，以PEX18Gm-up和PEX18Gm-down為引物，用DNA聚合酶擴增質粒PEX18Gm，PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，62 ℃ 25 s，72 ℃ 5 min，30個循環，72 ℃ 5 min。反應體系為25 μL，取5 μL PCR產物進行PCR鑒定。為了提高后期重組效率，需用限制性內切酶Dpn Ⅰ去除未線性化的環狀質粒，條件如下：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min。

1.3.1.2制備含目的基因上下游片段的PA0745-up+PA0745+PA0745-down 以PA14細胞株的DNA為模板，使用引物PEX0745-up和PEX0745-down擴增含上下游片段的PA0745-up+PA0745+PA0745-down，PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環；72 ℃ 5 min。反應體系為25 μL，取5 μL進行PCR鑒定之后，再進行測序驗證。

1.3.1.3利用重組酶連接目的片段和載體得重組質粒PEX0745 將克隆載體PEX18Gm和插入片段PA0745-up+PA0745+PA0745-down以摩爾比為1∶2的比例混合，利用重組酶進行重組反應得重組質粒PEX0745。反應條件如下：37 ℃ 30 min，4 ℃ 5 min。取5 μL進行PCR鑒定后，再進行測序驗證。

1.3.2PA0745基因突變質粒E126A、 E146A和ΔPA0745的構建 以重組質粒PEX0745為模板，分別使用對應引物擴增出發生126位點突變、146位點突變和PA0745基因缺失的重組質粒E126A、E146A和ΔPA0745。PCR反應條件如下：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，30個循環；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產物進行PCR鑒定之后，進行測序驗證。為了去除PCR產物中的質粒模板，需要對其進行Dpn Ⅰ酶切，條件如下：37 ℃ 2 h，80 ℃ 20 min。對酶切產物進行磷酸化及連接，反應條件如下：25 ℃ 5 min，16 ℃ 1 h。

1.3.3采用等位基因替換原理構建銅綠假單胞菌PA0745基因突變株 PEX18Gm為穿梭質粒，它可以通過結合轉移的方法從大腸桿菌S17-1轉移至銅綠假單胞菌，然后整合到其基因組中。PEX18Gm攜帶可以在大腸桿菌中用于質粒復制的復制子、Gm抗性基因和帶有具有負選擇性標記的基因SacB。基于銅綠假單胞菌可以利用檸檬酸作為碳源，而大腸桿菌不可以這一特點，利用僅含檸檬酸作為碳源的培養基VBMM作為第1次同源重組的篩選。另外，SacB基因的表達產物是果聚糖蔗糖酶，30 ℃條件下能催化蔗糖水解生成對大腸桿菌有致死作用的果聚糖。因此，SacB基因的表達會殺死生長在含有蔗糖培養基上的大腸桿菌，可以用做第2次同源重組的篩選。

分別將成功制備的重組質粒E126A、E146A和ΔPA0745轉化到大腸桿菌S17-1感受態細胞中，后涂布于含有30 μg/mL Gm的LB瓊脂板上，37 ℃培養過夜。

用LB培養基1∶1稀過夜培養的銅綠假單胞菌PA14細胞株，于42 ℃環境熱阻斷3～6 h，以體積比為1∶6的比例與對數期供體菌S7-1混合，用濾器過濾使細菌置于濾膜上，再把濾膜貼于LB瓊脂板上，30 ℃孵箱孵育過夜。

1.3.4銅綠假單胞菌PA14突變株篩選鑒定 首先，利用含50 μg/mL Gm的VBMM瓊脂糖平板進行第1次同源重組篩選；其次，利用含10%蔗糖的NSLB瓊脂糖平板進行第2次同源重組篩選；最后，利用PIA瓊脂糖平板分離銅綠假單胞菌，進行測序驗證，得到銅綠假單胞菌PA14突變株E126A、E146A和ΔPA0745。

1.3.5銅綠假單胞菌PA0745基因突變株的生物學特性

1.3.5.1生長曲線測定 將銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株E126A、E146A和ΔPA0745的過夜菌，分別按照1∶100的比例加入到3 mL新鮮的LB培養基和20% LB培養基中，37 ℃振蕩培養2 h和3 h后，測OD600值，以后每0.5 h取樣，測OD600值，繪制細菌體外生長曲線。

1.3.5.2細胞侵染實驗 用含10% 胎牛血清(FBS)無抗生素的DMEM培養基調整對數期的銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株E126A、E146A和ΔPA0745OD600為0.1，首先，細菌與巨噬細胞RAW264.7按照10∶1的感染復數(MOI)混合，37 ℃共孵育1 h。其次，培養基替換成含10% FBS和150 ng/mL Gm的DMEM培養基，37 ℃孵育1 h，用以除去細胞外銅綠假單胞菌。最后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，0.5% Triton X-100裂解細胞，梯度稀釋后，涂布于LB瓊脂糖平板上，次日對進入細胞內的細菌進行計數。

2 結 果

2.1重組載體的鑒定 以重組質粒PEX0745為模板，擴增出PA0745基因點突變株的質粒E126A、E146A和基因缺失株APA0745，并測序，測序結果與預期結果一致，見圖1。

1：PA0745基因和其上下游800 bp片段；2：PA0745基因的上下游800 bp片段；3：pEX18Gm質粒線性化

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2PA14細胞株的PA0745基因突變株的特性 分別測試了PA14細胞株的PA0745基因突變株E126A、E146A和ΔPA0745在營養充足(LB)和營養缺陷(20% LB)的環境下的生長曲線。細菌在20% LB的生長條件下，8 h后細菌達到生長平臺期，OD600為1.5左右，而在營養充足的LB生長條件下，8.5 h后細菌達到生長平臺期，OD600為2.0左右。但不論細菌是在LB培養基中還是20% LB培養基中培養，PA14野生型菌株與突變株生長并沒有差異，說明PA0745基因突變后不影響PA14細胞株的生長，見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌PA14細胞株及突變株在LB(A)和20% LB(B)中生長曲線

2.3突變PA0745基因抑制銅綠假單胞菌細胞侵染能力比較 PA0745基因敲除后，銅綠假單胞菌侵入細胞的能力相較于野生型PA14細胞株下降了79.34%，具有催化活性的126、146位谷氨酸分別突變成丙氨酸后，相較于野生型PA14細胞株，細菌侵染能力也分別下降了29.51%及60.66%，見圖3。

圖3 銅綠假單胞菌PA14細胞株及其突變株侵染巨噬細胞RAW264.7能力比較

3 討 論

慢性皮膚潰瘍創面為銅綠假單胞菌的存活提供良好的“培養基”，使創面遷延不愈。而在近年相關研究中發現巨噬細胞在創面愈合過程中起總指揮的作用，當細菌大量繁殖擴增，使局部炎性反應及細胞因子的生物學效應減弱，影響巨噬細胞對抗炎和促進修復的調控。這為臨床醫生對慢性皮膚潰瘍細菌感染的抗菌治療提供理論依據[11]。

本研究通過同源重組的原理成功構建了銅綠假單胞菌PA0745基因突變株：E126A、E146A和ΔPA0745，通過生長曲線測定，各突變株與野生型PA14菌株之間并無明顯差異，說明PA0745基因的功能缺失并不影響PA14細胞株的生長。通過巨噬細胞侵染實驗考察PA0745基因對銅綠假單胞菌致病性的影響，發現相較于野生株PA14，PA0745基因各突變株的細胞侵染能力均出現了不同程度的下降。上述實驗結果表明，以生物膜擴散信號分子形成過程中的關鍵酶為靶點，設計抗菌藥物的可行性，由于它僅抑制細菌的致病性而不直接殺死細菌，這種抗菌藥物將大大降低耐藥菌株的產生。同時本實驗從細菌侵染宿主方面證明了PA0745基因作為抗菌藥物靶點的潛力，為開發針對PA0745基因靶點的新型抗菌藥物提供理論基礎[12]。

本研究針對銅綠假單胞菌生物膜擴散信號分子CDA生物合成的關鍵酶PA0745基因的功能展開了研究，在后續工作中，本課題組將通過對比分析銅綠假單胞菌野生型PA14和PA0745基因敲除株基因表達譜，深入研究CDA在銅綠假單胞菌內參與調控的下游信號通路，以期為以PA0745基因為靶點的小分子抑制劑的篩選提供理論基礎和可行性分析。

[1]徐鳳琴，黃松音，莫紅平，等．sRNA phrs調控銅綠假單胞菌生物膜形成的功能研究[J]．中華醫院感染學雜志，2017，27(10)：2169-2172．

[2]劉華之，侯良．皮膚創傷后銅綠假單胞菌生物膜感染的治療效果研究[J]．當代醫學，2016，22(16)：7-8．

[3]AMARI D T,MARQUES C N,DAVIES D G.The putative enoyl-coenzyme a hydratase dspi is required for production of the pseudomonas aeruginosa biofilm dispersion autoinducer cis-2-decenoic acid[J].J Bacteriol,2013,195(20):4600-4610.

[4]SEPEHR S,RAHMANIBADI A,BABAIENAIEJ H,et al.Unsaturated fatty acid,cis-2-decenoic acid,in combination with disinfectants or antibiotics removes pre-established biofilms formed by food-related bacteria[J].PLoS One,2014,9(7):e101677.

[5]JENNINGS J A,COURTNEY H S,HAGGARD W O.Cis-2-decenoic acid inhibits S.aureus growth and biofilm in vitro:a pilot study[J].Clin Orthop Relat Res,2012,470(10):2663-2670.

[6]RAHMANI B A,SEPEHR S,FALLAHI H,et al.Dissection of the cis-2-decenoic acid signaling network in Pseudomonas aeruginosa using microarray technique[J].Front Microbiol,2015,6:383.

[7] TAN D,CRABB W M,WHITMAN W B,et al.Crystal structure of DmdD,a crotonase superfamily enzyme that catalyzes the hydration and hydrolysis of methylthioacryloyl-CoA[J].PLoS One,2013,8(5):e63870.

[8]SPADARO F,SCOFFONE V C,CHIARELLI L R,et al.The crystal structure of burkholderia cenocepacia DfsA provides insights into substrate recognition and quorum sensing fatty acid biosynthesis[J].Biochemistry,2016,55(23):3241-3250.

[9]SRIVASTAVA S,CHAUDHARY S,THUKRAL L,et al.Unsaturated lipid assimilation by mycobacteria requires auxiliary cis-trans enoyl CoA isomerase[J].Chem Biol,2015,22(12):1577-1587.

[10]HMELO L R,BORLEE B R,ALMBLAD H,et al.Precision-engineering the Pseudomonas aeruginosa genome with two-step allelic exchange[J].Nat Protoc,2015,10(11):1820-1841.

[11]陳宏．巨噬細胞PPARγ對皮膚傷口愈合的作用研究[D]．重慶：第三軍醫大學，2015．

[12]FONG J,YUAN M,JAKOBSEN T H,et al.Disulfide bond-containing ajoene analogues as novel quorum sensing inhibitors of pseudomonas aeruginosa.[J].J Med Chem,2017,60(1):215-227.