鹽溶蛋白電泳和SSR標記鑒定蘇玉20種子純度的比較研究

王波+彭宏+羅緒標+郭玲

摘要： 為建立一套經濟、快速、準確鑒定蘇玉20純度的方法，利用鹽溶蛋白電泳和SSR標記同時對該品種進行了純度鑒定，并對2種方法及結果進行了比較分析。研究發現，同一批次種子，2種方法純度結果基本一致，但鹽溶蛋白電泳法純度結果比SSR分析結果平均高0.78百分點。經綜合分析，在實際操作中，建議用SSR標記，利用1～2對引物即可完成蘇玉20 的純度鑒定，其結果更真實準確。

關鍵詞： 玉米種子；蘇玉20；鹽溶蛋白；SSR標記；純度鑒定

中圖分類號： S513.037 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0072-02

鹽溶蛋白電泳一直是種子企業鑒定玉米種子純度的主要方法之一。該方法簡單、便于操作，對技術人員和檢驗設備要求不高，一般的種子企業檢驗室都可開展該項工作，因此在實際檢驗工作中被廣泛應用。包和平等利用玉米鹽溶蛋白PAGE法和田間小區種植鑒定法對吉林省生產商應用的16個雜交玉米種子純度進行測定，試驗表明，同一樣品種子純度田間小區鑒定普遍高于蛋白PAGE法鑒定純度值，純度越高2種方法所測值偏差越小[1]。郭景倫等將玉米雜交種子純度室內鑒定結果與田間種植鑒定結果進行了對比研究，結果表明，2種方法鑒定結果較吻合，一般相差在5.0%以內，并且玉米種子純度越高，室內鑒定結果和田間鑒定結果相差越小；純度越低，2個結果差異越大[2]。

但鹽溶蛋白PAGE法有一定的局限性，有些品種雙親蛋白質水平上的差異較小，難以鑒定；鑒定大批量玉米種子純度時，藥品配制量大且步驟繁瑣，有些試劑容易失效；另外鹽溶蛋白的電泳譜帶分辨率低，有時會出現誤讀或譜帶難以辨別，因此對結果判定有一定的影響。近幾年來隨著SSR分子標記的發展和應用，表現其獨特的優越性。孟慶長等以蘇玉20雜交種及其親本為材料，篩選出在蘇玉20雙親之間多態性明顯、重復性較好的4對引物bnlg1306、phi065、bnlg2291和umc1590用于蘇玉20鑒定[3]。此標記特異性好，田間鑒定與利用SSR標記鑒定結果高度一致。本試驗利用孟慶長等篩選的4對引物，結合鹽溶蛋白電泳法對蘇玉20種子純度進行鑒定，并比較分析，驗證2種試驗結果的相關性，以便建立一套適應蘇玉20品種純度準確、快速鑒定的試驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇玉20雜交種及其親本蘇951和蘇651種子均由江蘇明天種業科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 鹽溶蛋白電泳法 參照NY/T 449—2001《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》。

1.2.2 SSR分子標記 切取少量胚乳，利用堿煮法[4]提取玉米基因組DNA。利用文獻[3]中提供的4對引物（表1）用于蘇玉20純度鑒定，所用引物由上海英俊生物工程有限公司合成。PCR反應體系：DNA模板1.0 μL，Super Taq Mix 5.0 μL（上海浦迪生物科技有限公司），ddH2O 3.0 μL，上下游引物（2.0 μmol/L）各0.5 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應在BIO-RAD 5808R型PCR儀上進行。

PCR反應產物在30%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（N，N-亞甲基二丙烯酰胺 ∶丙烯酰胺=1 ∶29）分離1.5 h后，經0.2% AgNO3銀染后顯色，拍照觀察并記錄。

2 結果與分析

2.1 鹽溶蛋白及SSR分子標記電泳結果參照農業行業標準NY/T 449—2001《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》，將待檢批次的蘇玉20及其父、母本蛋白質上樣，電泳并分析（圖1）。結果表明：蘇玉20及其親本自交系間存在差異，且雜交種F1代和雙親譜帶互補。圖1中，有1個泳道的譜帶呈偏母本型，可能是母本接受外來花粉造成的混雜，可以確定為非雜交種。這表明鹽溶蛋白電泳可用于蘇玉20品種純度鑒定。

利用孟慶長等篩選出的4對引物[3]對蘇玉20雜交種及親本進行擴增，其中引物umc1590經PCR擴增后，F1代圖譜出現3條互補帶，因此不建議作為區分此品種的首選引物。而引物bnlg1306、phi065、bnlg2291經PCR擴增后父母本各為1條帶，雜交種為雙親的2條互補帶，可很好地區分（圖2）。

2.2 2種方法的結果比較

對10個不同批次種子同時用2種方法進行對比（表2），研究發現，同一批次種子，蛋白電泳純度數值比SSR分子標記數值高平均0.78百分點，差異范圍在-0.8～3.1百分點。2種方法數值有一定的相關性，種子純度越高，2種方法數值越接近，如果純度越低，SSR分子標記數值相對越低。

為進一步驗證篩選出的3對引物能否很好地鑒定品種純度，每一粒種子經玉米單粒磨碎儀研磨后，取少許胚乳做DNA模板，對應的種胚做鹽溶蛋白電泳。經比較，2種方法的純度結果基本吻合（表3）。另外研究發現，152個檢測樣品，4個母本自交系種子在不同引物標記及蛋白電泳檢測中表現均一致，而經phi065檢測顯示為父本的個體在其他方法中顯示為F1代，經bnlg1306和蛋白電泳檢測顯示為雜株的個體在其他檢測方法中顯示為F1代。這種現象可能和玉米種子在不同發育時期蛋白表達不同有關。同時也說明在實際工作中，應結合該批種子是自交苗、回交苗、其他類型雜株還是遺傳不穩定因素，根據實際情況，選擇合適的引物對，對各單株檢測結果進行綜合判定，確定待測雜交種的純度。

3 討論與結論

劉宏魁等利用鹽溶蛋白PAGE法和SSR分子標記對先玉335和澤玉11指紋圖譜進行了分析，研究發現，鹽溶蛋白法可大批量用于純度檢測，對于難以鑒定的品種可用SSR分子標記法作為輔助手段進行鑒定[5]。本試驗以同一玉米種子為材料，提取不同取樣部位的基因組DNA，利用SSR分子標記法和鹽溶蛋白電泳法對蘇玉20純度進行了鑒定，結果表明2種方法均可區分親本自交系和雜交種。這說明堿煮法適于蘇玉20的提取，鹽溶蛋白電泳法也可以用于此品種的純度鑒定。

試驗中利用3對SSR引物和蛋白電泳進行比較（表3），研究發現2種方法結果比較吻合。但各個引物的SSR標記圖譜和蛋白電泳圖譜個別個體表現并非一一對應，這正解釋了SSR標記作為一種隨機DNA標記，個體在不同引物間存在一定差異，而SSR 標記和鹽溶蛋白法個體的差異表現正說明蛋白質電泳圖譜易受種子（或幼苗）發育階段及表達器官的影響，不夠穩定從而影響了鑒定結果的準確性。這和趙久然的研究結果[6]是一致的。

參考文獻：

[1]包和平，曹麗娟，楊 光. 用鹽溶蛋白PAGE法檢測雜交玉米種子純度[J]. 中國種業，2006（6）：36-37.

[2]郭景倫，趙久然，王風格，等. 玉米雜交種純度室內與田間鑒定結果比較研究[J]. 種子世界，2004（7）：22-24.

[3]孟慶長，陳艷萍，楊興華，等. 利用SSR技術鑒定蘇玉20的純度[J]. 江蘇農業學報，2009，25（3）：508-512.

[4]王建華，田寶華，楊麗維，等. 玉米單粒播種子質量評價與檢測技術手冊[M]. 北京：中國農業大學種子科學與技術研究中心，46-52.

[5]劉宏魁，閆洪朗，原亞萍. 應用鹽溶蛋白電泳和SSR分子標記鑒定玉米種子純度的研究[J]. 安徽農業科學，2011，39（19）：11396-11398.

[6]趙久然. 玉米種子真實性和品種純度鑒定新方法[J]. 北京農業科學，1999（3）：25-40.