灰樹花多糖結構特點及其生物活性研究進展

張宗啟，吳天祥，2*，劉力萍

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 明德學院，貴州 貴陽 550025）

灰樹花（Grifola frondosa）是一種珍貴的藥食兩用真菌，隸屬于擔子菌門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，又名貝葉多孔菌、千佛菌、蓮花菌、栗子蘑等，日本稱之為“舞茸”（Maitake），美國稱之為“林雞”（hen of the woods）[1-2]。在我國主要分布于云南、四川、河北、黑龍江、吉林、廣西、西藏、福建等地。野生灰樹花主要產于海拔800～1 400 m的闊葉林下，喜好溫暖的氣候和潮濕的土壤，其形態可分為菌絲體和子實體兩大部分，其中菌絲體作為灰樹花深層發酵的產物，顏色為乳白色，形態呈大小均勻的球形；而作為可食部分的子實體是一種富含蛋白質、維生素E和多種礦質元素的營養食品[3]。

此外，灰樹花也是一味具有保健功能的中藥。我國傳統醫學認為，灰樹花甘涼、無毒，具有清除暑熱、補脾益氣的功效。在藥用上，具有許多醫療和保健功能。經常食用子實體，對治療高血壓、肥胖癥有一定療效。其中，灰樹花最大的藥用價值是由灰樹花菌絲體、子實體與發酵液中分離的一類富含β-（1→6）、β-（1→3）糖苷鍵的真菌多糖，即灰樹花多糖（Grifola frondosapolysaccharide，GFP）。類似于絕大多數的真菌多糖（如靈芝多糖，蟲草多糖等），灰樹花多糖也具有中藥生物活性，如抗腫瘤[4-5]、抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）[6]、調節機體免疫力[7]、抗氧化[8]和清除自由基[9]等。但多糖結構復雜，鏈鍵結構共分為α型和β型兩種，其中β構型是多糖擁有生物學活性的主體部分[10]。

目前關于灰樹花多糖的研究，大多數以灰樹花多糖產量及多糖的生物學活性為出發點，探尋優化多糖產量培養基、添加外源物誘導多糖產量、分離純化所得多糖和多糖的抗氧化、抗腫瘤等活性，對灰樹花多糖分子結構同生物學活性之間的關聯研究較少。所以本文以灰樹花多糖一級結構為出發點，旨在探討灰樹花多糖的結構特征與生物學活性之間的關系。1多糖結構及特征

多糖是一種多聚物，有同型多糖和異型多糖兩大類之分。一些生物學活性與其自身的結構、糖苷鍵的連接方式、分子質量、聚合度以及直鏈的分支度有關。通常情況下，研究多糖的物理化學及結構特征主要包括多糖分子質量、糖苷鍵的類型、糖苷鍵的位置、單糖組成等方面[11-12]。研究基本化學結構的方法通常有紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析等[13]。表1列舉了20種灰樹花多糖，包含多糖分子質量、單糖組成、化學結構和生物學活性等。

1.1 多糖分子質量（純度）

多糖的性質在一定程度上由多糖分子質量大小決定，即多糖分子質量的測定為多糖的性質奠定了基礎。多糖分子質量有不同的鑒定手段，如高效液相色譜法、高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、黏度法、滲透壓和蒸汽壓法等。實驗室鑒定多糖分子質量通常使用高效液相色譜法和高效凝膠滲透色譜法[32]。MA X L等[22]通過高效液相色譜法測得灰樹花多糖GFP-A的分子質量為8.5×105Da。ZHAO C等[23]應用高效凝膠滲透色譜法對灰樹花深層發酵多糖GFP1進行檢測，結果為4.1×104Da。此外，張媛媛等[33]通過高效液相色譜法測得灰樹花子實體多糖GFD-1的分子質量為3.0×104Da。由此可以得出，不同種類、不同實驗條件下的灰樹花多糖分子質量不同，但范圍近似于104～106Da之間。

1.2 多糖的單糖組成

單糖組成是研究多糖結構的一個重要指標，通常研究多糖的單糖組成，先通過酸解、衍生化處理使糖苷鍵斷裂，再采用紙層析、薄層層析及氣相色譜法測定等。近些年，高效液相色譜法也運用于單糖和低聚糖的分析，可實現不需衍生化直接上樣使其操作簡便且有較高的分辨率[34]。在目前的研究中，因為多糖的來源不同，灰樹花多糖中單糖的組成存在差異。YANG B K等[28]在分離分析灰樹花發酵菌絲體多糖EX-GF，得到了3種多糖：EX-GF-Fr.I、EX-GF-Fr.II、EX-GF-Fr.III。其單糖組成如表1所示。LI Q等[20]在分離純化灰樹花富硒粗多糖時，得到多糖Se-GFP-22，通過氣相色譜分析得，該多糖含甘露糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖，比例為3.3∶23.3∶1.0。由此得出，不同種類、不同的實驗手段下灰樹花多糖的單糖組成和比例也不盡相同。

此外，多糖的分子質量和單糖組成一定程度上決定多糖溶液的黏稠度。通常情況下，分子質量低、單糖組成在三種之內的多糖溶液顏色較淺且不黏稠，反之，分子質量大、單糖組成種類較多的多糖溶液顏色較深且黏稠呈凝膠狀。一般按多糖黏稠度來劃分，黏稠度最大的是灰樹花子實體多糖，其次是灰樹花菌絲體多糖，最后是灰樹花深層發酵多糖。

1.3 化學結構

同多糖的分子質量和單糖組成兩指標相比而言，多糖一級結構的測定較為困難，除了實驗步驟繁瑣之外，對多糖的純度也有很高的要求。目前，主要通過有機波譜的方法最大程度上解析多糖結構。ZHAO C等[23]對分離純化后具有抗病毒活性的灰樹花多糖GFP1進行傅里葉-紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）和核磁共振一維氫譜分析，結果發現多糖GFP1主要由β-（1→6）-D-葡聚糖組成的主鏈，支鏈主要由α-（1→3）-D-葡聚糖組成，整個多糖分子結構有較高的延展性。此外，WANG Y等[18]通過傅里葉-紅外光譜、完全酸水解、Smith降解、甲基化分析、核磁共振一維碳譜、氫譜和二維易核位移相關譜對灰樹花多糖GFPBW2進行結構分析，結果表明，此多糖主要由β-（1→3）-D-葡聚糖和β-（1→4）-D-葡聚糖為主鏈，支鏈是通過C-6號位上的O-6與β-D-葡聚糖相連，具體結構式見圖1。

表1 不同的灰樹花多糖分子質量、結構及生物學活性Table 1 Molecular mass,structure and bioactivities of different kinds of polysaccharides fromG.frondosa

續表

圖1 灰樹花多糖GFPBW2重復單元結構Fig.1 Structure of the GFPBW2 repeating unit ofG.frondosapolysaccharides

2 多糖的生物活性

自20世紀80年代開始，許多科學家對灰樹花多糖的生物活性進行了大量藥理作用實驗與臨床試驗，結果表明，灰樹花多糖具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤及促進膠原蛋白合成等作用。

2.1 抗氧化活性

自然界中諸多生物，如動植物、細菌及真菌等，自身本就分泌較強的抗氧化物質，其中就包括多糖。基于抗氧化的各種測定方法與活性指標，抗氧化活性一直是作為中藥真菌多糖營養保健和治療效果機理的重點研究對象[35]。目前，國內外有大量研究表明灰樹花多糖具有抗氧化活性。CHEN G T等[36]在灰樹花多糖GFP抗氧化的研究中，通過分離純化得到GFP-1、GFP-2和GFP-3這3種多糖，研究3種多糖對3種自由基清除率、還原力、亞鐵離子螯合能力及大鼠肝臟脂肪氧化的抑制率四個方面的影響，結果表明，3種多糖均有抗氧化能力，其中GFP-2較GFP-1和GFP-3的抗氧化活性最強。同樣，LEE B C等[37]發現灰樹花菌絲體多糖G-2、G-3、P-1、P-3有顯著的生物活性，其中G-2、G-3有較強的抗氧化活性，P-3還能夠促進纖維原細胞的增殖，顯著增加了膠原質的纖維合成，合成率達80%，所以，此結論一方面論證了灰樹花多糖具有強抗氧化能力的同時，另一方面還證實了多糖具有顯著提高成纖維細胞增殖的能力。

2.2 免疫調節活性

一直以來，免疫調節活性被視作多糖重要的生物活性功能，其主要作為生物調節劑和免疫調節劑使用。MENGM等[38]研究了灰樹花子實體多糖GFP在小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7的增殖活性，結果發現GFP在一定范圍內可以顯著促進RAW264.7的增殖且顯著增強細胞免疫刺激活性，如細胞因子和趨化因子的形成等。NORIKO K等[39]研究灰樹花多糖的免疫調節活性，提取到灰樹花D-組分，把此組分多糖作用于正常的荷瘤小鼠，觀察到其能影響小鼠的正常免疫系統，包括巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等。NK細胞能直接攻擊細菌和病毒感染后的細胞，并產生γ-干擾素，進而調節正常和特定的免疫系統，將多糖連續3 d注射小鼠后，對巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞進行分析，結果顯示灰樹花多糖組分能活化NK細胞，刺激機體的免疫力。韓麗榮等[40]在研究中發現，灰樹花多糖A組分免疫活性時發現，A-組分能夠提高RAW264.7細胞分泌NO的能力，并提升了腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等細胞因子的分泌以及細胞中iNOS的mRNA的表達水平，CD3+T淋巴細胞在一定程度上反映了細胞免疫的整體水平。

2.3 抗腫瘤活性

多糖的抗腫瘤活性往往與分子質量大小、水溶解度大小及結構的分支程度有關。通常分子質量越大，水溶解度越高，則多糖抗腫瘤活性就越高。多糖通過不同的機制對腫瘤細胞有抑制作用，目前被接收抗腫瘤的機制主要概括如下四類：（1）口服多糖預防腫瘤發生；（2）改善對腫瘤的免疫反應；（3）誘導腫瘤細胞凋亡；（4）預防腫瘤細胞在體內擴散和遷移[41]。王艷停[42]研究灰樹花多糖（GFP）抑制人結腸癌細胞HT-29情況發現，在一定濃度范圍內GFD可明顯抑制HT-29的細胞增殖，從蛋白水平檢測發現，GFD可造成HT-29細胞內胞內磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）蛋白表達下調，促分裂原活化蛋白激酶蛋白表達上調，引起線粒體上的B淋巴細胞瘤-2-基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達下降、Bax蛋白表達上升，使誘導細胞凋亡因子Caspase-8蛋白表達上調，進而促進人體結腸癌細胞HT-29細胞發生凋亡。MAO G H等[24]在提取水溶性灰樹花多糖GP11后，研究其對肝癌腫瘤細胞的抑制能力時發現，當GP11劑量在108mg/kg時肝癌細胞抑制能力最高，最高可達56.16%。LIN E S等[43]在研究中也發現，從所篩選出的灰樹花TFRI1073菌株中提取到的灰樹花胞外多糖，能對肺癌（A549細胞）和乳腺癌（MDA-MD-231細胞）癌細胞株起明顯的抑制作用。

2.4 其他生物活性

除了上述3種生物活性外，灰樹花多糖還具有降血糖、抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）等活性功能。周富川等[44]研究發現，灰樹花多糖GFP-2能促進PI3k/Akt（磷脂酰肌醇3-激酶）胰島素信號通路關鍵蛋白的活性，促使GSK-3（糖原合成酶激酶3）表達量的下降，從而使糖原合成的代謝增強，改善胰島素抵抗功效，最終實現降低血糖的功能。MA X等[45]在建立人肝癌細胞HepG2模型發現，灰樹花多糖可以增強HepG2細胞對葡萄糖的攝取，激活細胞膜中的胰島素受體蛋白，增加磷酸化-AktSer473的產生，從而緩解胰島素抵抗作用。趙霏等[46]以重組的HBV DNA全基因組和抗G418質粒轉染人肝癌細胞株HepG2建立的細胞株HepG2.2.15細胞為模型，對灰樹花多糖的藥理作用研究表明，灰樹花多糖（maitake polysaccharide，MP）雖然對HepG2.2.15細胞增殖影響較小，但對乙肝表面抗原（HBeAg）的分泌和HBV DNA的復制有較強的抑制作用，因此灰樹花多糖可以作為一種有效低毒的抗HBV藥物，為臨床應用提供理論支持。

3 多糖分子質量、結構特點及生物學活性的關聯

不同品種、處理手段及實驗方法所得多糖的分子質量、結構和生物學活性是不相同的。多糖不同的生物活性取決于其結構參數，如分子質量、水溶性、取代基團、取代位置、取代程度、單糖種類及糖苷鍵位置等分子構造緊密相關。近年來，關于多糖結構與功能的關系研究較少。就灰樹花而言，其多糖結構與生物學活性之間沒有明確的研究來分析它們之間的關聯性，根據目前研究，有些關聯可推斷如下：

（1）眾所周知，多糖的分子質量與其生物學活性密切相關，較高的分子質量可以更好的維持多糖的空間構像，進而一定程度上影響多糖的生物活性。CUI F J等[26]在分離純化灰樹花多糖GFG-3后得到多糖GFG-3a、GFG-3b和GFG-3c，其中GFG-3a純度最高、分子質量也最高。在抗腫瘤細胞活性的研究中發現，GFG-3與GFG-3a對小鼠肉瘤細胞S180和人體肝癌細胞Bel7402抑制率明顯較強，且GFG-3a抑制效果略高于GFG-3。此外，對于多糖提取而言，不同的多糖提取條件會直接影響多糖分子質量的大小。OHNO N等[47]通過研究不同方法對灰樹花子實體多糖的提取發現，熱水提法、冷堿提法和熱堿提法所得β-（1→3）-D-葡聚糖的分子質量不同，分別為5.6×106Da、7.5×105Da和1.2×106Da。此外，SUCH等[48]通過對多糖溫度調控時發現，不同的提取溫度（如70℃、100℃和121℃）會顯著的影響（1→3）-D-葡聚糖和（1→6）-D-葡聚糖的含量，進而影響多糖分子質量和水溶性多糖的生物活性。

（2）多糖可分為三大類：中性多糖、酸性多糖和堿性多糖（殼聚糖）。其中酸性多糖是由糖醛酸組成的復雜的酸性碳水化合物，而糖醛酸可以改變碳水化合物相關的物理化學性質和溶解性，從而影響多糖的抗氧化活性等。簡而言之，富含糖醛酸的多糖有更高的抗氧化活性[49]。CHEN Y等[50]研究靈芝子實體多糖時，分別對靈芝多糖組分PSG-1及PSG-2進行體外抗氧化活性實驗，結果表明含糖醛酸含量多的PSG-2表現出較強的抗氧化性。

（3）有研究報道，多糖的結構：如以β-（1→3）連接方式為主鏈的多糖對抑制腫瘤的活性較強，主要是因為它能夠通過激活巨噬細胞活性的功能，增加了免疫細胞的活性，產生和釋放TNF-a激活補體系統等途徑，形成天然和獲得性免疫系統對腫瘤細胞的免疫應答[51]；除此之外，β-（1→6）-D-葡聚糖同樣是構成多糖具有免疫調節和抗腫瘤活性的物質[52]。在已對灰樹花生物學活性的報道中，OHNO N等[52]研究證明β-（1→4）-葡聚糖不參與灰樹花多糖的抗腫瘤活性，且得到具有抗腫瘤活性的β-（1→3）-D-葡聚糖，此葡聚糖具有螺旋和天然兩種構型；另有研究證明[53]β-（1→3）-D-葡聚糖在灰樹花子實體中呈現一種具有高自由度的天然狀態。此外，MASUDA Y等[31]在對灰樹花抗腫瘤研究中發現，灰樹花多糖組分MZF結構中主鏈含有β-（1→3）-D-葡聚糖和β-（1→6）-D-葡聚糖，具有較強的抗腫瘤活性。所以基于灰樹花多糖結構方面的研究對多糖抗腫瘤機制的揭示是非常重要的。

（4）一系列化學修飾，如硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙酰化和硒化等，能顯著提高多糖的生物活性。其中硫酸化中硫酸根基團能使端基碳的氫原子活潑，增加多糖聚合電解質和親核性、增加與金屬鐵的接觸，從而增強清除力；羧甲基化和乙酰化能將多糖支鏈上的羥基被羧甲基和乙酰基取代，使多糖結構伸展，提高多糖在水中的溶解度；而硒化多糖具有有機硒和多糖雙重的藥理作用，能產生更強的活性[54-55]。ZHAND W N等[56]在對灰樹花培養液中分離得到胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），通過羧甲基化和硒化修飾，得到羧甲基胞外多糖（carboxymethyl-EPS，CM-EPS）和富硒胞外多糖（Se-EPS），通過比較三種多糖的抗氧化和抗腫瘤活性發現，CM-EPS和Se-EPS的抗氧化能力明顯優于EPS，且同EPS相比，Se-EPS能顯著抑制Hela細胞的增殖，結果得出，羧甲基化和硒化對提高灰樹花胞外多糖的抗氧化和抗腫瘤活性有很大的影響。MAO G H[57]在研究富硒多糖生物活性時發現，灰樹花硒多糖Se-GP對于DPPH自由基、ABTS自由基和氫自由基的清除能力均高于多糖GP，且同濃度情況下，Se-GP對氫自由基的清除率最高。

4 結論和展望

目前，隨著基因組學、轉錄組學和蛋白質組學這三大組學的快速發展，“糖組學”這個概念，作為一種新的研究領域被更多的研究者所探究，這也將為灰樹花多糖的開發利用提供寶貴的研究前景。根據自身所具有的活性功能，灰樹花多糖已被數家食品行業、保健品行業和醫藥行業所研究為有效保健品。此外，對多糖分子結構而言，由于灰樹花多糖的分子質量及結構的復雜多樣性，多糖的結構特點同生物學活性之間并未建立系統有效的關系，需要研究者們進一步研究總結二者的相關性。如果能進一步的解析灰樹花多糖的結構特點及其生物活性作用機制，那么灰樹花多糖將作為一種高效的生長調節劑在食品工業、醫療行業等工業領域得到更廣泛的應用。總而言之，灰樹花多糖會因自身價格低廉、毒副作用低、藥源性廣等特點，在醫療行業上繼續用來進行動物體內實驗與臨床研究，從而進一步說明此大分子化合物對人類醫藥行業的貢獻性。

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