海洋高產低溫葡萄糖氧化酶菌株的篩選、鑒定及酶學性質研究

李 蓉，喬 慧，王曉輝，張慶芳，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）EC1.1.3.4是一類同源二聚體糖蛋白酶，能夠以分子氧為電子受體，高效催化葡萄糖轉化為葡萄糖酸并產生過氧化氫[1-2]。GOD具有分解葡萄糖、除氧、抑菌、保鮮等[3]作用，被廣泛用于葡萄糖傳感器、食品、生物燃料電池、飼料添加劑等[4-7]領域。

GOD普遍存在微生物與昆蟲體內，前者因代謝優勢成為研究重點。現有生產GOD野生菌株的研究集中于黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉屬（Penicilliumsp.）的少數種類[8]。前者合成胞內酶，后者可分泌胞外酶，同時青霉屬分泌的酶催化能力更強[9-10]。目前菌株GOD酶活普遍較低[11-12]，市場價格昂貴，同時商品化的GOD基本為中高溫酶[13]，低溫（0～20℃）條件下催化效率低。這些不足限制了其在水產養殖、食品低溫保鮮等領域的應用。海洋環境常年低溫、寡營養的特點，孕育的微生物只需較低營養水平即可存活，并且通常會合成低溫酶[14]。因此，本研究以黃海、渤海海泥為樣品來源，篩選高產低溫GOD菌株，對其進行形態學與分子生物學鑒定，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和酶譜分析，對所產GOD分子質量和酶學性質進行初步研究，以期為低溫GOD的開發與應用提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

海泥樣品：采自大連黃海、渤海海域。

1.1.2 培養基

富集培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，渤海海水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

種子培養基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，渤海海水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

初篩培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO33 g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，CaCO310 g/L，鄰聯茴香胺7.5 mL/L，辣根過氧化物酶1.25 mL/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。其中CaCO3單獨滅菌，鄰聯茴香胺及辣根過氧化物酶參照范新蕾[15]的方法制備并過濾除菌。

發酵培養基：葡萄糖20.90 g/L，胰蛋白胨1.2 g/L，K2HPO41.25g/L，MgSO4·7H2O1.30g/L，FeSO4·7H2O1.80g/L，CaCO325.00 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

保藏培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

蛋白Marker：美國Thermo Fisher Scientific公司；鄰聯茴香胺：美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（60 U/mL）、Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司；DC-6低溫循環水浴鍋：江蘇金壇市天竟實驗儀器廠；HD-1360超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Multifugn XIR離心機、2700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀、MultiskanTMGO全波長酶標儀：美國ThermoFisherScientific公司；DYY-6C電泳儀、DYY-4C電泳儀：北京六一儀器廠；BSD-YX（F）3200恒溫搖床：上海博迅實業有限公司；AmiconUltra-15 30 kDa超濾管：美國Millipore公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱：美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法

菌株的初篩：稱取1g海泥樣品接種于富集培養基，20℃、160 r/min培養3 d。培養液梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于初篩培養基上，20℃倒置培養3～7 d，挑取產生棕色圈的菌株，經多次分離純化后得到的單菌落作為初篩菌。

菌株的復篩：使用無菌生理鹽水洗滌種子培養基上生長成熟的孢子，制成懸浮液（孢子數控制在106CFU/mL），以1%（V/V）的接種量接種于發酵培養基中，20℃、160r/min培養24h，測GOD酶活，選取酶活最高的菌株進行后續實驗。

1.3.2 菌株鑒定

形態學鑒定：通過觀察種子培養基上菌落形態，鏡檢菌株菌絲及分生孢子形態，對復篩菌株進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株DNA。利用ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）PCR擴增目的菌株ITSrDNA序列（PCR擴增體系：1 μL PCR產物（10 ng/μL），8 μL BigDye（2.5 x），1 μL 引物（3.2 pmol/μL），10 μL 滅菌去離子水；PCR擴增條件：96℃預變性1 min，96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4min，25個循環，4℃保溫）。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）中進行本地序列基本搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源比對，選取同源性較高的菌株ITSrDNA序列，采用MEGA5.0軟件中鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.3.3 純酶液的制備

粗酶液制備：菌株發酵液使用新華1號濾紙過濾除去菌球，濾液經8000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液。

硫酸銨鹽析：粗酶液中添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃鹽析24h。鹽析溶液經12000r/min離心10min，棄上清，得到蛋白沉淀。

超濾：蛋白沉淀經1 mol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液復溶后，使用Millpore 30 kDa超濾管在4 000 r/min條件下超濾20 min，取上層截留蛋白備用。

葡聚糖凝膠柱層析：選用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱，取超濾后的蛋白上樣，采用0.2 mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液洗脫，層析后收集純GOD酶溶液。

1.3.4 葡萄糖氧化酶活力的測定

H2O2標準曲線的繪制：本實驗在范新蕾[15]對GOD檢測方法的基礎上進行改進：在25 mL刻度試管中分別加入0.4 mL 10%葡萄糖溶液，2.5 mL鄰聯茴香胺溶液，0.1 mL辣根過氧化物酶溶液（60 U/mL）以及0～1 mL濃度44.1 μmol的H2O2溶液，20℃反應1 min，加入2 mL5 mol/L鹽酸終止反應，加蒸餾水至10 mL刻度線，在波長525 nm處測定吸光度值，以H2O2濃度（x）為橫坐標，吸光度值A525nm（y）為縱坐標，繪制H2O2標準曲線。

樣品中GOD酶活的測定：以純酶液替代反應體系中的H2O2測定吸光度值，按照標準曲線回歸方程計算樣品中H2O2含量及GOD酶活力。

葡萄糖氧化酶酶活定義：20℃條件下（pH值為7），1min催化生成1μmolH2O2所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

研討會于2018年9月20日在黑河學院明德樓2樓會議室舉行，共有來自北京大學、北京市社會科學院、黑龍江省社會科學院、齊齊哈爾大學、蒙古國成吉思汗大學、俄羅斯阿穆爾國立大學、日本城西國際大學、金澤星稜大學、松蔭大學，以及黑河學院部分單位的專家學者近20人。

相對酶活的測定：在一定反應體系下，某一條件下的酶活與最高酶活比值的百分比，即為GOD在該條件下的相對酶活（%）。

1.3.5 SDS-PAGE和酶譜實驗

SDS-PAGE參照LAEMMI U K[16]的方法進行。電泳后，使用考馬斯亮藍R-250染色。活性電泳在不含SDS和2-巰基乙醇的10%聚丙烯凝膠酰胺中進行。酶譜實驗在電泳后，凝膠浸沒于含0.1%的葡萄糖，2.5mmol/L鄰聯茴香胺和20μg/mL辣根過氧化物酶的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0 20 mmol/L）中，室溫染色20min。GOD活性條帶呈現棕紅色。根據SDS-PAGE和酶譜實驗結果，并結合標準蛋白分子質量，確定GOD的分子質量。

1.3.6 葡萄糖氧化酶酶學性質初步研究

酶的最適作用溫度：在pH 7.0條件下，分別于不同溫度（0、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）條件下測定GOD酶活力，確定最適反應溫度。

酶的熱穩定性：在pH 7.0條件下，將酶與緩沖液置于不同溫度條件（0、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）條件下保溫60 min后，以同組最高酶活為100%，計算各條件下GOD的相對酶活。

酶的最適作用pH值：在最適反應溫度條件下，分別測定不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）反應體系中的GOD酶活力，確定最適反應pH。

酶的pH值穩定性：在最適反應溫度條件下，將GOD于不同pH的緩沖體系（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）中保溫60 min后測定酶活力，以同組最高酶活為100%，計算各條件下GOD的相對酶活。

金屬離子對酶活的影響：在最適反應溫度條件下，反應體系中分別添加不同金屬離子（K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、NH4+、Fe3+、Mn2+），使金屬離子終濃度為5 mmol/L，測定不同條件下GOD酶活力，以未加金屬離子的反應體系為對照。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

從海泥中初篩到12株產棕色圈菌株，作為初篩葡萄糖氧化酶生產菌株，各菌株GOD酶活測定結果見表1。由表1可知，12株菌的GOD酶活為0.63～11.84 U/mL，其中菌株G01的GOD酶活最高，進一步對其進行鑒定。

表1 篩選菌株的葡萄糖氧化酶酶活Table 1 Glucose oxidase activities of screened strains

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌株G01的菌落形態和細胞形態結果見圖1。由圖1A可知，該菌在初篩培養基上生長良好，初期菌絲呈白色，圓形，中心凸起，菌落周圍先產生棕色圈。由圖1B可知，隨著菌落逐漸成熟，棕色圈逐漸褪去，產孢子后菌落表面呈綠色，粉末狀。這種現象與文獻[17]所報道GOD生產變化趨勢一致。由圖1C可知，菌株G01菌體頂端呈掃帚狀，存在分生孢子梗，其上有球狀分生孢子。初步判斷菌株G01屬于青霉屬（Penicilliumsp.）。

圖1 菌株G01菌落(A，B)及細胞(C)形態Fig.1 Colony(A,B)and cell(C)morphology of strain G01

2.2.2 分子生物學鑒定

菌株G01的ITS rDNA序列PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，在563 bp處有目的基因（GeneBank登錄號MG983918）。

圖2 菌株G01 ITS rDNA基因的PCR產物結果Fig.2 Results of PCR amplification product of ITS rDNA gene of strain G01

2.2.3 系統發育樹的構建

菌株G01的系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株G01與殼青霉（Penicillium crustosum）聚于一支，親緣關系最近。結合形態特征及分子生物學鑒定結果確定菌株G01為一株殼青霉（Penicillium crustosum）。

圖3 菌株G01基于ITS rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS rDNA gene sequences

2.3 SDS-PAGE及酶譜實驗

純化后GOD的SDS-PAGE和酶譜實驗結果如圖4所示。由圖4A可知，菌株G01所產GOD其單體大小為17 ku，與石漱玉等[18]的所報道的單體分子質量接近。由圖4B可知，GOD分子質量為95 ku。結合SDS-PAGE及酶譜實驗初步判斷該菌所產GOD為五聚體，與已報道[9]GOD為二聚體酶結果不同，推測該酶可能為一種新酶。

圖4 葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE電泳圖和酶譜分析Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis and zymography analysis of glucose oxidase

2.4 葡萄糖氧化酶酶學性質初步研究

2.4.1 酶的最適作用溫度

由圖5可知，在0～25℃范圍內，GOD酶活隨溫度的升高快速增大；當溫度高于25℃時，酶活開始逐漸減小；當溫度高于35℃時，酶活迅速降低，至溫度為55℃時，酶活僅存1.14 U/mL。因此，菌株G01所產GOD在低溫條件下具有高催化效率，最適作用溫度為25℃。

圖5 溫度對菌株G01產葡萄糖氧化酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on glucose oxidase activity produced by strain G01

2.4.2 酶的熱穩定性

由圖6可知，GOD在0℃處理60 min后，仍保留有50%以上的相對酶活，并且在4～20℃處理后，相對酶活仍基本保持100%。但在溫度高于20℃時，該酶相對酶活迅速降低，表明該GOD對熱敏感。結合該酶的最適作用溫度，表明該GOD擁有典型的低溫酶特征，屬于低溫酶。

圖6 菌株G01產葡萄糖氧化酶的熱穩定性Fig.6 Thermostability of glucose oxidase produced by strain G01

2.4.3 酶的最適作用pH值

由圖7可知，反應體系pH值＜4.5時，酶的活性隨pH的升高而增大；當pH值＞4.5時，酶活迅速降低；當pH值為4.5時，GOD酶活最高，為14.95 U/mL，因此該GOD最適作用pH值為4.5。

圖7 pH對菌株G01產葡萄糖氧化酶活的影響Fig.7 Effect of pH on glucose oxidase activity produced by strain G01

2.4.4 酶的pH值穩定性

圖8 菌株G01產葡萄糖氧化酶的pH值穩定性Fig.8 pH stability of glucose oxidase produced by strain G01

由圖8可知，該酶對pH值的穩定性差，過酸或過堿均會使其相對酶活降低，僅在pH值為4.5時活性穩定。因此，該GOD在后續應用中，應注意控制環境pH值。

2.4.5 金屬離子對酶活的影響

本研究選擇環境中常見離子，研究其對GOD酶活的影響，結果見圖9。由圖9可知，Mn2+對酶的活性有促進作用；K+和Na+對酶活無顯著影響；而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特別是Fe3+對酶活有明顯抑制作用。

圖9 不同金屬離子對菌株G01產葡萄糖氧化酶酶活性的影響Fig.9 Effect of different metal ions on glucose oxidase activity produced by strain G01

3 結論

本研究從黃海、渤海海域海泥樣品中篩選到12株產GOD菌株，其中菌株G01產酶能力最高，該菌株在20℃、160 r/min條件下發酵培養24 h，酶活可達到11.8 U/mL。根據形態學特征和ITS序列分析，鑒定菌株G01為一株殼青霉（Penicillium crustosum）。結合SDS-PAGE和酶譜分析初步確定菌株G01所產GOD單聚體分子質量為17 ku；與多數文獻所報道的GOD為二聚體蛋白不同，該GOD蛋白分子質量為95 ku，推測該酶為五聚體，這可能是海洋微生物合成GOD的特點，該酶可能為一種新型GOD。同時，該GOD分子質量較小，可以更容易通過縫隙與底物接觸，分析這可能是該酶相比其他來源GOD具有更高活性的原因。菌株G01所產GOD酶學初步性質顯示該酶最適反應溫度低（25℃），0～20℃時仍保留有50%以上的相對酶活，熱穩定性差，為典型低溫酶；最適反應pH值為4.5，且pH值穩定性差，屬于酸性葡萄糖氧化酶，適于作為水產飼料添加劑；Mn2+對GOD活性有促進作用；K+，Na+對酶活基本無影響；而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特別是Fe3+對酶活有明顯抑制作用。

本研究取得的成果，為潛在新型海洋低溫GOD的開發及其在低溫、水產飼料領域的應用奠定了基礎。后續將進一步研究該酶克隆表達、發酵優化等實驗，以期實現海洋低溫GOD的生產應用。

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