赤水曬醋中增黏微生物的分離鑒定及特性研究

楊 新，陳 莉，盧紅梅，白成松，楊華連，楊雙全*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

食醋是以糧谷為原料經(jīng)過(guò)糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而制成的含醋酸的液態(tài)酸味調(diào)味品[1]。其不僅作為一種調(diào)味品深受人們的喜愛(ài)，而且作為一種保健品被人們廣泛食用。研究表明[2-7]，食醋具有促進(jìn)食欲、保護(hù)胃腸道、抗菌殺菌、降血壓、抗氧化、抗衰老、促進(jìn)鈣的吸收、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗癌、防癌等功能。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產(chǎn)的一種具有典型地方特色的優(yōu)質(zhì)食醋產(chǎn)品，其選料考究、制作精良、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求高，具有不可復(fù)制的獨(dú)特性。傳統(tǒng)的赤水曬醋工序繁多，精湛復(fù)雜，需要中草藥制曲、大米精選、蒸煮、發(fā)酵、醋醅裝壇曝曬、醋醅浸淋、產(chǎn)品精釀、滅菌等三十六道工序，整個(gè)生產(chǎn)周期在兩、三年以上。由于傳統(tǒng)的赤水曬醋釀造工藝周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，難以滿足市場(chǎng)需求，因此部分企業(yè)對(duì)傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了改進(jìn)，以縮短工藝周期，提高產(chǎn)量，但是工藝的改變也給產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)了挑戰(zhàn)，部分新工藝產(chǎn)品出現(xiàn)了產(chǎn)氣、黏度增加等問(wèn)題，不僅影響了產(chǎn)品質(zhì)量安全，而且給企業(yè)信譽(yù)和形象造成了損害，而且類似問(wèn)題在其他食醋企業(yè)中也時(shí)有發(fā)生。因此進(jìn)行食醋中污染雜菌的相關(guān)研究成為食醋行業(yè)較為迫切的問(wèn)題，這對(duì)于促進(jìn)食醋行業(yè)的發(fā)展具有積極的意義。

本研究以出現(xiàn)黏度增加質(zhì)量問(wèn)題的赤水曬醋為研究對(duì)象，從中分離篩選出導(dǎo)致黏度增加的菌株，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)生理生化特征和16S rDNA基因序列分析對(duì)分離篩選所得到的菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)分離篩選得到的菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，以期為食醋中雜菌的防治提供理論基礎(chǔ)及參考，這對(duì)于保障赤水曬醋產(chǎn)品質(zhì)量安全、減少企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有切實(shí)的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黏稠的曬醋（食醋A）、正常的曬醋（食醋B）：均由某赤水曬醋企業(yè)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

碘化鉀、碘（均為分析純）：貴州賽蘭博科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉（分析純）：成都臨江化工廠；無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；剛果紅、孔雀綠（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；番紅（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、TaqDNA聚合酶、MgCl2（分析純）：上海生工生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-5D S11立式壓力蒸汽滅菌器、SN-CJ-IF潔凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DMS-653廣西生物數(shù)碼顯微鏡：深圳市博宇儀器有限公司；∑IGMAZEISS電子掃描顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：上海天平儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的分離、純化

將食醋樣品（食醋A）稀釋成10-1，吸取稀釋樣品0.2 mL，涂布接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[8]，然后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)3～5 d，同時(shí)接種正常食醋（食醋B）到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照。

選擇菌落數(shù)在3～30之間的平板，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離純化，傳代3次，并用相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基在4℃條件下保存?zhèn)溆肹9]。

1.3.2 增黏微生物的篩選

配制LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值至3.5，分裝到試管中滅菌，再將分離出的微生物接種到上述培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～5 d，用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)基的黏度[10]。同時(shí)，以不接種作為對(duì)照，計(jì)算其黏度增加百分比。

1.3.3 微生物形態(tài)觀察以及生理生化測(cè)定

將分離出來(lái)的主要微生物進(jìn)行菌落形態(tài)觀察（形態(tài)、顏色、邊緣、透明度等特征）以及個(gè)體形態(tài)觀察（染色顯微鏡觀察）。

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]和《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]分別對(duì)獲得的增黏微生物進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。生理生化試驗(yàn)包括：甲基紅試驗(yàn)（methyl red，MR）、過(guò)氧化氫酶酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、木糖發(fā)酵試驗(yàn)、L-阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)、D-甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)等，每種試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 16S rDNA基因序列分析

（1）微生物總DNA的提取

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）有限公司）提取實(shí)驗(yàn)菌株的DNA，其具體步驟參見(jiàn)試劑盒的說(shuō)明書(shū)。DNA提取產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中[13]。

（2）PCR擴(kuò)增16S rDNA

以提取的基因組DNA為模板，利用通用引物：正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3'）和反向引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。所有PCR均在25μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃變性50 s，56℃復(fù)性50 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[13]。

（3）DNA測(cè)序

純化后的目的基因送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用Chromas軟件參照正反序列圖譜進(jìn)行人工校正。

（4）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中與已知細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA5.10軟件的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，具體確定菌株的種屬[14-15]。

1.3.5 微生物生長(zhǎng)特性研究

活化菌種：將分離得到的菌株接種于裝液量為100 mL/250 mL LB液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)24 h。

（1）最適生長(zhǎng)溫度

取活化菌液1mL接種于裝液量為100mL/250mLLB液體培養(yǎng)基中，分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃溫度梯度下，各個(gè)溫度梯度下設(shè)置3個(gè)平行組，以空LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后用分光光度計(jì)測(cè)定各菌液的OD600nm值，通過(guò)測(cè)得的OD600nm值繪制各細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度曲線圖[16]。

（2）最適生長(zhǎng)pH

取活化菌液1 mL接種于裝液量為100 mL/250 mL LB液體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5、pH 9.5、pH 10.5，各pH梯度下設(shè)置3個(gè)平行組，以空LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后用分光光度計(jì)測(cè)定各菌液的OD600nm值，通過(guò)測(cè)得的OD600nm值繪制各細(xì)菌的最適生長(zhǎng)pH曲線圖[17]。

（3）最適生長(zhǎng)NaCl含量

取活化菌液1 mL接種于裝液量為100 mL/250 mL LB液體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置NaCl含量為0、1%、2%、3%、5%、7%、9%、11%、13%，各NaCl濃度梯度下設(shè)置3個(gè)平行組，以空LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后用分光光度計(jì)測(cè)定各菌液的OD600nm值，通過(guò)測(cè)得的OD600nm值繪制各細(xì)菌的最適生長(zhǎng)NaCl含量曲線圖。

（4）微生物生長(zhǎng)曲線

取活化菌液10 mL接種于裝液量為300 mL/500 mL LB液體培養(yǎng)基中，每種菌株做3組平行實(shí)驗(yàn)，將其置于最適溫度條件下，120r/min搖床培養(yǎng)，前16h每隔4h測(cè)定OD600nm值，之后每隔8 h測(cè)定OD600nm值，連續(xù)檢測(cè)4 d。以未接菌種的同批次LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照[18]。1.3.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.6、Excel 2016和Design-Expert等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每個(gè)處理組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離、純化結(jié)果

采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng)，涂有食醋A樣品的培養(yǎng)基中有微生物生長(zhǎng)，食醋B樣品中沒(méi)有微生物長(zhǎng)出。通過(guò)平板劃線對(duì)分離得到菌種進(jìn)行篩選純化，共得到11株菌，分別命名為菌株N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11。

2.2 黏度增加微生物的驗(yàn)證結(jié)果

將篩選得到的11株菌株接種在LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行黏度測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 食醋黏度增加驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Results of viscosity increment verification of vinegar

由表1可知，接種了菌株N1～N11的培養(yǎng)基黏度均有所增加，其中，接種了菌株N3、N5、N7和N11的培養(yǎng)基黏度增加很明顯，增加了33.62%～39.66%；接種了其他的菌株的培養(yǎng)基的黏度幅度均＜15%。菌株N3、N5、N7和N11明顯使食醋黏度增加，說(shuō)明導(dǎo)致食醋黏度增加的主要菌株是N3、N5、N7和N11。

因此，對(duì)菌株N3、N5、N7、N11這4株菌株進(jìn)行鑒定、分析，通過(guò)了解這4株菌的特性，從而控制這4株菌株的生長(zhǎng)，更能有效地控制食醋黏稠增加的現(xiàn)象。

2.3 增黏微生物形態(tài)觀察以及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株N3、N5、N7、N11的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 菌株N3、N5、N7、N11菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of strains N3,N5,N7 and N11

由圖1可知，菌株N3菌落呈乳白色，表面干燥褶皺，邊緣整齊，易挑起，不透明，該菌株為桿狀，長(zhǎng)約1.50 μm，直徑約0.72 μm。菌株N5菌落呈白色，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣呈放射狀，易挑起，不透明，該菌株為桿狀，呈現(xiàn)鏈狀，長(zhǎng)約1.68 μm，直徑約0.76 μm。菌株N7菌落呈棕色，表面干燥不平滑，邊緣不整齊，難挑起，不透明，該菌株為桿狀，長(zhǎng)約1.40 μm，直徑約0.65 μm。菌株N11菌落呈棕黃色，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊，易挑起，不透明，該菌株為桿狀，長(zhǎng)約1.24 μm，直徑約0.73 μm。

按文獻(xiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》分別對(duì)4株菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strains

續(xù)表

圖2 菌株N3(A)、N5(B)、N7(C)和N11(D)基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strains N3(A),N5(B),N7(C)and N11(D)based on 16S rDNA sequence

由表2可知，菌株N3、N5、N7和N11的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、木糖發(fā)酵試驗(yàn)、L-阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)、D-甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)呈陽(yáng)性，石蕊牛奶試驗(yàn)呈陰性。同時(shí)菌株N3的甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）也呈陽(yáng)性，而菌株N5、N7和N11的甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）呈陰性。通過(guò)對(duì)比《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可知，菌株N3、N5、N7和N11均呈現(xiàn)芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的主要特征，其具體菌種有待進(jìn)行分子鑒定。

2.4 16S rDNA基因序列分析及基因系統(tǒng)發(fā)育分析

采用16S rDNA測(cè)序方法對(duì)菌株N3、N5、N7和N11進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（BLAST）對(duì)比，采用鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2（A）可知，菌株N3的16SrDNA基因序列與Bacillus licheniformis的相似度最大，為100%。結(jié)合菌株N3的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)及生理生化特征可以鑒定菌株N3為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。由圖2（B）可知，菌株N5的16S rDNA基因序列與Bacillus amyloliquefaciens的相似度最大，為84%。結(jié)合菌株N5的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)及生理生化特征可以鑒定菌株N5為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。由圖2（C）可知，菌株N7的16S rDNA基因序列與Bacillus licheniformis的相似度最大，為99%。結(jié)合菌株N7的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)及生理生化特征可以鑒定菌株N7為索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）。由圖2 D）可知，菌株N11的16S rDNA基因序列與Bacillus acidicola的相似度最大，為100%。結(jié)合菌株N11的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)及生理生化特征可以鑒定菌株N11為酸居芽孢桿菌（Bacillus acidicola）。

2.5 微生物生長(zhǎng)特性的研究

2.5.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度的確定

圖3 溫度對(duì)菌株N3、N5、N7和N11生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的上升，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值均呈先增加后降低的趨勢(shì)，在30～40℃溫度范圍內(nèi)，OD600nm值上升比較緩慢；在40～45℃溫度范圍內(nèi)，OD600nm值上升較快；當(dāng)溫度為45℃時(shí)，OD600nm值達(dá)到最大值，之后OD600nm值快速下降。因此菌株N3、N5、N7、N11的最適生長(zhǎng)溫度均為45℃。

2.5.2 pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

圖4 pH值對(duì)菌株N3、N5、N7和N11生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由圖4可知，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值隨pH值的升高均呈先增加后降低的趨勢(shì)，且分別在pH8.5、4.5、4.5和5.5時(shí)，OD600nm值達(dá)到最大值，因此，菌株N3、N5、N7、N11的最適pH值分別為8.5、4.5、4.5和5.5。

2.5.3 NaCl含量對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

圖5 NaCl含量對(duì)菌株N3、N5、N7和N11生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of NaCl content on the growth of strains N3,N5,N7 and N11

由圖5可知，隨著NaCl含量的增加，菌株N3、N5、N7、N11的OD600nm值呈先增加后降低的趨勢(shì)，菌株N3、N7、N11的OD600nm值在NaCl含量為1%時(shí)達(dá)到最大值，而菌株N5的OD600nm值在NaCl含量在NaCl含量為2%時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加NaCl含量，菌株OD600nm值逐漸下降，當(dāng)NaCl含量為7%時(shí)，菌株N7的OD600nm值為0；當(dāng)NaCl含量為9%時(shí)，菌株N3、N5、N11的OD600nm值幾乎為0。因此，菌株N3、N7、N11的最適生長(zhǎng)NaCl含量均為1%；菌株N5的最適生長(zhǎng)NaCl含量為2%。

2.5.4 微生物生長(zhǎng)曲線

圖6 菌株N3、N5、N7和N11的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of strains N3,N5,N7 and N11

由圖6可知，菌株N3、N5、N7和N11在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律符合典型的S形生長(zhǎng)曲線，在LB液體培養(yǎng)基中的延遲期都比較短，能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。菌株N3、N5、N7和N11分別在30 h 、20 h、16 h和40 h后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。因此菌株N3、N5、N7和N11具有較快的生長(zhǎng)速度，對(duì)數(shù)期開(kāi)始比較早。

綜上所述，導(dǎo)致食醋黏稠增加的主要的微生物是幾種耐熱耐酸的芽孢桿菌。根據(jù)這些菌株特點(diǎn)，可以采取一些措施來(lái)進(jìn)行防范，如杜絕生醋連日存放，配兌后的生醋立即滅菌，減少微生物在食醋中生長(zhǎng)繁殖；避免總酸5 g/100 mL以下生醋存放過(guò)夜；過(guò)程交叉污染將導(dǎo)致脹桶桿菌增殖泛濫，交叉污染主要包括生熟醋交叉、好壞醋交叉、生產(chǎn)場(chǎng)所污染等，因此，工廠管理者應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量管理、保證潔凈的操作環(huán)境、養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，堅(jiān)決杜絕交叉污染[19-21]。

3 結(jié)論

本研究在恒溫培養(yǎng)箱中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)樣品（食醋A）進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)劃線分離純化得到11株菌，經(jīng)黏度增加驗(yàn)證試驗(yàn)，得到導(dǎo)致黏稠增加的4株主要菌株。通過(guò)其菌落菌株形態(tài)、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鑒定菌株N3為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、菌株N5為解淀粉芽孢桿菌菌株（Bacillusamyloliquefaciens）、菌株N7為索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）、菌株N11為酸居芽孢桿菌（Bacillus acidicola）。4株菌的生長(zhǎng)特性研究表明，其最適生長(zhǎng)溫度均為45℃；菌株N3、N5、N7、N11的最適生長(zhǎng)pH值分別為8.5、4.5、4.5和5.5；菌株N3、N7、N11的最適生長(zhǎng)鹽度均為1%，菌株N5的最適生長(zhǎng)鹽度為2%；菌株N3、N5、N7、N11在LB液體培養(yǎng)基中均具有較快的生長(zhǎng)速度和較強(qiáng)的繁殖能力。本研究結(jié)果為食醋中雜菌的防治提供了理論參考，對(duì)保障赤水曬醋產(chǎn)品質(zhì)量安全、減少企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有切實(shí)的意義。

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