朗姆酒發酵過程中微生物群落結構及其動態演替

張葦莉，楊慧敏，胡景輝，樊曉璐，鄒 毅，李 楠*

（1.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 糖業工程研究中心，廣西 南寧 530004）

朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗糖蜜為原料，經酒精發酵、蒸餾、陳釀、勾兌、過濾等一系列工序后得到的一種蒸餾型酒精飲品。其口感豐富，香醇芳郁，且有保健效果，深受人們喜愛[1-2]。朗姆酒的發酵是以酵母作為主發酵菌種，通過添加丹多液進行共發酵，丹多液中的多種微生物及甘蔗自帶微生物發酵產生的代謝產物對酒體的影響和風味物質的形成具有重要意義，如乳酸桿菌在朗姆酒發酵過程中為酒體添香和風味物質形成提供前體物質[3-4]，因此，了解發酵過程中微生物群落多樣性的變化將有助于科學地認識朗姆酒釀酒微生物菌群代謝，對朗姆酒品質的提高具有重要意義[5]。傳統微生物群落多樣性主要通過分離培養技術、生物標記法和現代分子生物學免培養等技術獲得[6-7]。進入21世紀，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術開始應用于白酒微生物群落結構的研究，但是該技術具有分辨率低（僅能檢出少數優勢種群）、條帶回收困難、難以定量確定條帶比例等缺點[8-9]。高通量測序技術是在近年來快速發展并廣泛應用于多學科多領域的微生物群落多樣性檢測技術，如土壤[10]、湖泊[11]、淤泥[12]等生態環境，香腸[13]、米酒[14]、醋[15]等發酵食品，利用高通量測序技術不需要進行單菌落分離提取，便可直接在微生物基因水平上獲取群落資源，該方法具有通量高，效率高，測序快，覆蓋率高等優點[16]，在保證測序深度和測序質量的條件下，可獲得較為全面的微生物群落多樣性評估信息[17]。

本研究主要通過高通量測序技術研究朗姆酒發酵中的微生物群落結構及其動態變化規律，確定發酵進程中各階段的優勢菌種，以期為朗姆酒生產與質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朗姆酒發酵液：廣西海酩威釀酒股份有限公司；土壤基因組提取試劑盒：美國MP Biomedicals公司；DNA聚合酶AP221-02、Trans DNA 15KMarker：北京全式金生物技術（TransGen Biotech）公司；產物回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

JulaboTW12恒溫水浴鍋：優萊博技術有限公司；Nano Drop 2000紫外可見分光光度計、ST16R高速冷凍離心機、PICO17小型臺式離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GeneAmpR9700型PCR儀：美國ABI公司；QuantiFluorTM-ST DNA定量儀：美國Promega公司；Illumina Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別取發酵第1天、2天、3天、4天、5天的朗姆酒發酵液（記為樣品A1、A2、A3、A4、A5），取樣方法為5點取樣法，從發酵罐（取樣深度80 cm左右）四角及中心處取樣品，在無菌條件下混合均勻后，后冷凍保存于-80℃。

1.3.2 樣品總DNA提取、PCR擴增及檢測

將朗姆酒發酵液樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，由美吉公司采用土壤基因組提取試劑盒提取總DNA，具體操作方法按照試劑盒內說明書操作。先進行細菌和真菌特異區域的PCR擴增。16S rDNA V3-V4區的測序引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[18-19]；ITS1區的引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[20]。將全部實驗樣本進行重復試驗。用凝膠回收試劑盒回收PCR產物，用Tris-HCl洗脫，并將PCR產物用DNA熒光定量系統進行檢測定量。1.3.3測序文庫構建、測序與拼接

構建Miseq文庫時，需通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區域外端；后使用凝膠回收試劑盒切膠將PCR產物進行回收；然后用Tris-HCl緩沖液來洗脫產物，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；最后利用氫氧化鈉對PCR產物變性的原理，產生單鏈DNA片段。利用Illumina Miseq高通量測序儀進行雙端測序（paired-end sequencing）。將Miseq測序得到的PE reads根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，得到樣品的有效序列，校正序列方向，使用FLASH和Trimmomatic軟件得到優化序列[21]。1.3.4數據分析

將測序結果在美吉公司的I-sangerz在線生物信息分析平臺上進行分析。樣品標記區分后，采用Usearch軟件進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析。對于相似性水平≥97%的OTU進行生物信息統計，其中每個OTU代表一個物種[22]。基于OTU聚類分析和各個分類水平下物種的比對結果，利用Qiime軟件對OTU進行多樣性指數分析，以及對測序深度進行檢測[23]；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。即在各個分類水平上統計各樣品微生物群落組成。其中，細菌16SrDNA V3-V4區采用Sliva細菌數據庫比對；真菌ITS1區采用Unite真菌數據庫比對。同時采用Qiime軟件和RDP Classifier算法，選擇置信度閾值≥0.9，進行物種注釋和豐度分析[24]。為評估微生物分類與環境變量之間的相關性，基于分類學信息的基礎上利用Qiime軟件對微生物群落和環境因子的相關性進行Mantel text分析[25-26]。

Rank-abundance曲線是分析多樣性的一種方式。構建方法是統計單一樣品中，每一個OTU所含的序列數，將OTUs按豐度（所含有的序列條數）由大到小等級排序，再以OTU等級為橫坐標，以每個OTU中所含的序列數（也可用OTU中序列數的相對百分含量）為縱坐標，使用97%相似度的OTU，利用R語言工具制作曲線圖。Rank-abundance曲線可用來解釋多樣性的兩個方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線平滑程度反映了樣品中物種的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻[27]。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計及Alpha多樣性統計

2.1.1細菌多樣性分析

對5個樣品的細菌群落進行測序分析，共得到187063條有效序列，樣品的細菌群落多樣性指數見表1。

表1 細菌多樣性指數分析Table 1 Index analysis of bacterial diversity

Coverage指數指各樣本文庫的覆蓋率，反映測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況，其數值越高，表示樣本中序列被測出的概率越高；Chao指數和Ace指數用來估計樣本中物種豐富度，Chao指數越大，表示總物種種類越多，Ace指數越大，表明樣本的真實物種種類越多；Shannon指數和Simpson指數是物種均勻度和豐富度的綜合指標，用來估算樣本中群落多樣性，Shannon指數越大，Simpson指數越小，表明群落多樣性越高。由表1可知，樣品的Coverage

指數均＞99.9%，表明測序深度已覆蓋到測試樣品中的大部分物種，可以真實展示樣品中的絕大數細菌；Chao指數和Ace指數總體上呈現先減小后增大的趨勢，第2天最小，表明此時發酵液中細菌物種種類最少，第5天最大，表明此時發酵液中細菌物種種類最豐富；Shannon指數先增大后減小，Simpson指數先減小后增大，發酵第3天時，Shannon指數最大，發酵第3天和第4天時，Simpson指數小于第1、2、5天，表明此時發酵液中細菌群落多樣性最大，第5天時，Shannon指數最小，Simpson指數最大，表明此時發酵液中細菌群落多樣性最小。

2.1.2 樣品細菌群落的Rank-abundance曲線

圖1 細菌群落的Rank-abundance曲線Fig.1 Rank-abundance curves of bacterial community

圖1 為朗姆酒發酵過程中5個階段細菌的Rank-abundance曲線。由圖1可知，細菌物種相對豐度：第3天＞第4天＞第2天＞第5天＞第1天；物種均勻度：第3天＞第4天＞第2天＞第1天＞第5天，第1天的細菌相對豐度最小，表明此時細菌物種種類最少，第5天均勻度最小，表明此時發酵液中各物種所占比例差異較大，第3天的朗姆酒發酵液中物種豐富度和均勻度均最大，表明此時發酵液中細菌種類最多，且各物種所占比例相似，群落多樣性最大。

結合表1和圖1可知，第1天開始，細菌群落多樣性增加，這是因為起始階段細菌大多來源于甘蔗表皮帶入的天然微生物，這些細菌在適應新生境過程中，出現了種類和構成的急劇變化，第3天，丹多液的添加帶來了大量的細菌，使得此時發酵液中細菌物種最豐富，群落多樣性最大。2.1.3真菌的多樣性指數分析

對5個樣品的真菌群落進行測序分析，共得到168185條有效序列，樣品的真菌群落多樣性指數見表2。

由表2可知，樣品的Coverage指數均＞99.9%，可以真實展示樣品中的絕大多數真菌；第1天時，Ace指數和Chao指數最大，表明此時真菌的物種種類最為豐富；第2天稍有減少，第3、4、5天，Ace指數和Chao指數出現了較大幅度的降低，表明此階段真菌種類大幅減少，這可能是由于發酵液中微生物產生的代謝產物改變了發酵液的理化特性，不適宜真菌的生長，從而降低了真菌的多樣性；第5天Ace指數和Chao指數最小，此時發酵液中真菌種類最少；第2天，Shannon指數最大，Simpson指數最小，說明此時發酵液中真菌群落多樣性最大，第3、4、5天，Shannon指數大幅度降低，Simpson指數大幅度增加，表明此階段真菌群落多樣性大幅減少。

表2 在97%相似水平下真菌多樣性指數分析Table 2 Index analysis of fungal diversity at 97%similar level

2.1.4 真菌的Rank-abundance曲線

圖2 真菌群落的Rank-abundance曲線Fig.2 Rank-abundance curves of fungal community

圖2 為朗姆酒發酵過程中5個階段真菌的Rank-abundance曲線，由圖2可知，真菌物種相對豐度：第1天＞第2天＞第4天＞第3天＞第5天，物種均勻度：第2天＞第1天＞第4天＞第5天＞第3天，結合表2和圖2可知，第1天真菌種類最多，但此時的群落多樣性不是最大，這是由于各真菌物種所占比例差異較大，物種均勻度小，第2天真菌種類相較第1天有所減少，但此時的群落多樣性最大，這是因為此時物種均勻度大，各真菌物種所占比例相似，第3天以后真菌物種豐富度和均勻度大幅降低。

結合細菌多樣性和真菌多樣性結果可知，細菌的Chao指數和Shannon指數均大于真菌，表明在朗姆酒發酵過程中細菌種類和群落多樣性始終大于真菌。

2.2 朗姆酒發酵期間菌群群落結構變化分析

2.2.1 朗姆酒發酵期間細菌群落結構變化分析

采用RDP classifier對各樣品中的OTU進行細菌門和屬水平分析，獲得7個門，包括放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）和其他（others）相對豐度較小的門細菌；17個屬，包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、酵單胞菌屬（Zymomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、普雷沃菌屬（Prevotella）等。

圖3 門水平上細菌樣本群落組成分析Fig.3 Composition analysis of bacterial community at the phylum level

門水平上的細菌群落結構如圖3所示。由圖3可知，發酵第1、2、3天朗姆酒發酵液中優勢菌門為藍細菌門（Cyanobacteria），次優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），隨著發酵的進行藍細菌門（Cyanobacteria）的細菌比例逐漸減少，厚壁菌門（Firmicutes）的細菌比例逐漸增多，第4天開始，厚壁菌門（Firmicutes）繼續增加迅速成為優勢細菌，到發酵第5天比例達到最大值，在發酵液中比例為96.93%。

圖4 屬水平上細菌樣本的群落組成分析Fig.4 Composition analysis of bacterial community at the genus level

屬水平上的細菌群落結構如圖4所示。由圖4可知，發酵第1、2、3天，朗姆酒發酵液中的優勢菌屬為未分類的藍細菌屬（unclassified-Cyanobacteria），其次為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、酵單胞菌屬（Zymomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）等。第1天，藍細菌屬在發酵液中所占比例最大，這可能是因為藍細菌能較快的適應新環境，隨后其比例開始逐步減小，但仍處于優勢地位，而乳酸桿菌屬所占比例從第1天開始逐步增加，第4天乳酸桿菌屬取代藍細菌屬成為發酵液中優勢菌屬，且在發酵第5天所占比例達到最大值96.51%，這一現象現在瀘型酒發酵過程中也同樣存在，栗連會[28]的研究中，對瀘型酒酒醅中乳酸菌群落進行功能預測并模擬發酵驗證，發現乳酸菌在碳水化合物代謝中參與最多的是糖酵解途徑，還具有合成丁酸、丙酸代謝的潛力。張艷[29]的研究也發現，通過乳酸菌與酵母的相互作用，乳酸菌可通過影響酵母菌的生長和代謝來調節釀造微生物區系的平衡和白酒呈味物質的產生，對醬香基酒的品質產生一定影響。結合朗姆酒生產工藝，朗姆酒在發酵過程中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）通過發酵產生乳酸，并與酒精反應生成乳酸乙酯，乳酸乙酯與酵母菌發酵得到乙酸乙酯混合，這對朗姆酒特殊風味的形成具有重要意義。

2.2.2 朗姆酒發酵期間真菌群落結構變化分析

采用RDPclassifier對各樣品中的OTU依次進行真菌門和屬水平的信息分析，共獲得4個門，包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和未分類真菌（unclassi fied Fungi）和其他門真菌；11個屬，主要有未分類的酵母菌屬（unclassifiedSaccharomyces）、枝氯霉屬（Ramichloridium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、間座殼屬（Diaporthe）等。

樣品在門水平上的真菌群落結構如圖5所示，由圖5可知，子囊菌門（Ascomycota）在整個發酵過程中始終處于優勢地位，第1天，其在發酵液中所占比例最小為99.47%，隨后一直增加，第3天比例達到100%，第1、2天發酵液中有少量的擔子菌門（Basidiomycota）一些未分類真菌以及其他門真菌，第3天以后，整個發酵液中全部為子囊菌門真菌。

圖5 門水平上真菌樣本的群落組成分析Fig.5 Composition analysis of fungal community at the phylum level

樣品在屬水平的真菌群落組成如圖6所示，由圖6可知，第1天，發酵液中的優勢真菌為酵母屬，其所占比例＞90%，其次為枝氯霉屬（Ramichloridium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、間座殼屬（Diaporthe），隨后酵母屬在發酵液中的比例逐步增加，并一直處于優勢地位，第5天比例最高，為99.77%，而其他真菌屬比例逐步減小，第3天以后發酵液中只剩少量的鐮刀霉屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）和大量的酵母屬（Saccharomyces）。

圖6 屬水平上真菌樣本的群落組成分析Fig.6 Composition analysis of fungal community at the genus level

2.3 樣品的Beta多樣性分析

2.3.1 細菌屬水平的PCA主成分分析

對發酵過程中5個樣本的細菌進行屬水平上的主成分分析（principal component analysis，PCA）分析，結果如圖7所示。由圖7可知，發酵第1天和第2天樣品的距離較近，第4天和第5天樣品的距離較近，表明這兩個階段細菌屬組成相似度高，第3天和第5天距離最遠，表明這一階段細菌屬多樣性大，這是因為添加丹多液帶來了大量的細菌，使得此時發酵液中細菌物種和種類極為豐富，組成最為復雜。

圖7 屬水平上細菌樣本的PCA分析Fig.7 Principal component analysis of bacteria samples at the genus level

2.3.2 真菌屬水平的PCA主成分分析

對發酵過程中5個樣本的真菌進行屬水平上的PCA分析，如圖8所示。由圖8可知，第1、2、3天樣品間距離遠且分散，表明此階段發酵液中真菌組成相似度低，群落多樣性大，第3、4、5天樣品距離近且集中，表明此階段發酵液中真菌組成相似度高，群落多樣性小。這是因為第3天后發酵液中其他屬的真菌逐漸消失，發酵液中主要真菌為酵母屬。

圖8 屬水平上真菌樣本的PCA分析Fig.8 Principal component analysis of fungal samples at the genus level

2.4 樣品的環境因子分析

2.4.1 OUT水平上細菌的Mantel test分析

為得到樣品細菌群落與環境因子相關性，利用Qiime軟件對細菌群落和各環境因子進行OUT水平上的Mantel text分析，結果如表3所示。

表3 OUT水平上細菌的Mantel test分析Table 3 Mantel test analysis of bacteria at the OUT level

Mantel text可用來分析微生物群落與環境因子的相關性，R值越接近1，表明微生物群落與環境因子越正相關，越接近-1表明兩者越負相關，0表示兩者不相關。

由表3可知，以OUT為分類水平，在置換檢驗次數為999次的情況下，pH值與細菌群落多樣性呈正相關，糖含量、糖含量和pH與細菌群落多樣性呈負相關，且pH值（P＞0.05）、糖含量、糖含量和pH值對細菌群落多樣性影響均不顯著，但三種環境因子中，pH值對細菌群落多樣性的顯著性水平最高，因此是影響細菌群落多樣性的主要因素。

2.4.2 OUT水平上真菌的Mantel test分析

為得到樣品真菌群落與環境因子相關性，利用Qiime軟件對真菌群落和各環境因子進行OUT水平上的Manteltext，結果如表4所示。

表4 OTU水平上真菌的Mantel test分析Table 4 Mantel test analysis of fungal at the OUT level

由表4可知，以OUT為分類水平，在置換檢驗次數為999次的情況下，pH值與真菌群落多樣性呈正相關，且pH值對真菌群落多樣性有顯著的影響（P＜0.05），糖含量、糖含量和pH值對真菌群落多樣性影響均不顯著（P＞0.05）。

3 結論

本研究采用高通量測序方法系統鑒定了朗姆酒發酵過程中細菌和真菌微生物菌群多樣性，共鑒定得到到53個細菌菌屬和25個真菌菌屬。高通量測序結果表明，朗姆酒發酵液中細菌群落多樣性始終大于真菌，且細菌群落多樣性在第3天添加丹多液后達到最大，此階段中主要優勢細菌為未分類的藍細菌屬（unclassified-Cyanobacteria），第5天的群落多樣性最小，此階段主要優勢細菌為厚壁菌門的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；真菌群落多樣性在第2天最大，第3天后真菌群落多樣性一直減小，且其物種組成相似度高，整個發酵過程中，酵母菌始終屬于優勢真菌。通過Manteltext分析微生物群落與環境因子間的相關性，結果顯示，在OUT水平上，三種環境因子中，影響細菌群落多樣性和真菌群落多樣性的主要是pH值，且真菌群落多樣性與pH值之間具有顯著正相關（P＜0.05）。

本試驗為研究微生物對朗姆酒風味物質的形成提供理論依據，對后續優勢功能菌的分離篩選以及人工接種風味菌以提高朗姆酒質量奠定了堅實的基礎。

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