青藏高原土壤低溫產蛋白酶菌株的篩選及酶學性質研究

權淑靜，馬 煥，王一雯，解復紅，劉德海*

（1.河南省工業酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008；2.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008）

蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，執行許多不同的生理功能[1]。蛋白酶是應用最廣泛的酶制劑之一，可用于食品加工、洗滌劑、醫藥診斷、釀造、皮革、蛋白水解以及紡織、化妝品等的生產和生物材料的提取上[2-5]。根據蛋白酶催化溫度大致分為高溫酶、常溫酶和低溫酶。低溫蛋白酶最適催化溫度在40℃以下，并且在20～30℃仍能保持較高酶活（50%以上）[6]。低溫蛋白酶最適催化溫度接近自然環境中的溫度，對熱敏感，與中高溫蛋白酶相比具有催化效率高、節能、省時等特點，因此在食品、冷水洗滌、醫用疫苗等行業更具優越性[7-9]。產低溫蛋白酶菌株多篩選自天然低溫環境中，由于生存環境溫度較低，為了能更好地利用環境中的資源，經過長期的進化適應，它們分泌的胞外蛋白酶的最適酶活溫度也較低[10]。自20世紀70年代以來，世界上已有許多實驗室在從事低溫蛋白酶的研究，目前，已從海水、嗜冷的魚類和貝類以及高山、南北極泥土、天山等樣品中分離到產低溫蛋白酶菌株[11]，主要有假單胞菌屬（Pseudomorms）、黃桿菌屬Flavobacterium）、交替單胞菌屬（Alteromonas）等[12-14]。

“世界屋脊”青藏高原平均海拔4 000 m以上，大片地區年平均氣溫不足10℃，海拔高、氣溫低，生態條件獨特而復雜，是研究地學、生物學、資源與環境等領域的天然實驗室。作者于2012年采集沿川藏線和青藏線的青稞田、小麥田、馬鈴薯田土壤樣品13份，并進行了菌株的分離保藏。對分離菌株進行產酶活性的評估，發現分離到的菌株能產生多種胞外酶，比如有的菌株產生淀粉酶[15]。該研究在低溫條件下對高原菌株功能性蛋白酶進行了篩選，以期尋找低溫蛋白酶生產菌株，為高原菌資源利用提供科學依據，為今后工業應用和進一步開展分子生物學方面的研究及低溫蛋白酶產品的應用與開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

通過對來源于青藏高原土壤樣品進行微生物菌種的分離、培養與篩選，獲得產蛋白酶菌株，活性最高的一株篩選自拉薩郊區小麥根際土壤，命名為LS20-2。

1.1.2 培養基

1.0%脫脂奶粉平板分離培養基：（1）脫脂奶粉1 g，蒸餾水50 mL，115 ℃蒸汽滅菌15 min；（2）蛋白胨1.0 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1.0 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水50 mL，121 ℃蒸汽滅菌25 min。將兩瓶溶液混勻后倒平板。

液體發酵培養基：酪蛋白1.0 g，酵母粉0.4 g，葡萄糖1.0g，K2HPO40.1 g，Mg2SO40.02 g，蒸餾水100 mL，pH自然，115℃蒸汽滅菌20 min。

斜面保藏培養基：LB培養基。

1.1.3 主要試劑

DNA提取試劑盒：美國Promega公司；2×EsTaqMaster Mix：北京康為世紀生物科技有限公司；通用引物27F、1492R：深圳華大基因科技有限責任公司；Trans2K Marker：北京全式金生物技術有限公司；脫脂奶粉：美國BD公司；福林酚試劑：美國Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、酵母粉：英國Oxid公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Multifuge X1R離心機：德國Thermo公司；Thermoblock PCR擴增儀：德國Biometra公司；System蛋白質雙向電泳系統：美國BIO-RAD公司；QYC-2012C恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；722紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低溫條件下產蛋白酶菌株的篩選

菌株初篩：采于青藏高原的土樣用梯度稀釋法分離菌株并保藏于-80℃。將保存的高原菌種接種于LB平板，20℃活化培養48 h，用滅菌牙簽挑取單菌落點接于脫脂奶粉平板中，在4～20℃之間低溫培養，挑選可以在低溫條件下生長并產生水解圈的菌落，選取透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株作為初篩的產蛋白酶菌株。

菌株復篩：將低溫下能產蛋白酶的菌株接種于液體發酵培養基中，20℃發酵72～96 h后離心，取上清，測定發酵液中蛋白酶活性，選取活性最高的菌株。

粗酶液的制備：將發酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液。

蛋白酶酶活測定方法：參照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》方法。底物和酶液分別在40℃條件下預熱2 min，取0.5 mL稀釋到合適倍數的酶液，與0.5 mL底物在40℃條件下準確反應10 min，立即加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應。40℃條件下繼續保溫10min后離心，取0.5mL上清液加入0.4mol/L碳酸鈉2.5 mL，混勻加入0.5 mL福林酚試劑，混勻后在40℃保溫20 min。對照管終止反應后再加底物。以水代替濾液做空白調儀器零點，用分光光度計測定波長680 nm處樣品與對照管OD680nm值，通過線性回歸方程求出生成酪氨酸濃度。標準曲線用不同濃度的酪氨酸來制定。

蛋白酶活力單位（U/mL）定義：每1 mL酶液在一定溫度與pH條件下1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量。

相對酶活[16]：相對酶活是以同組實驗中活性最高點的值為100%，其余實驗點的值與該點的值之比，通常以百分數表示。

1.3.2 菌株的鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行菌株形態觀察、菌體特征描述[17]。菌株的16S rDNA序列分析，具體步驟如下：

（1）基因組DNA提取：按細菌DNA提取試劑盒操作手冊進行。

（2）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：擴增體系為50 μL，包括無菌雙蒸水19 μL，正向和反向引物各2 μL，模板DNA2 μL，2×EsTaqMasterMix25 μL。PCR擴增引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）'；1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）'。反應條件：每個反應30個循環，每個循環包括94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min；最后72℃延伸10 min，首次循環在95℃條件下預變性2 min。

（3）瓊脂糖切膠純化

用DNA膠回收試劑盒回收1 500 bp左右的目的片段，電泳檢測純化后DNA純度和含量。

（4）目的片斷的TA克隆和篩選

以pGEMR-T為載體進行TA連接，連接體系為10 μL，包括2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，pGEMR-T Vector 1 μL，PCRproduct3μL，T4DNA Ligase 1 μL。于42℃條件下轉化到E.coliDH5α菌株。最后涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中。通過藍白斑篩選陽性克隆。

（5）質粒DNA提取和菌落PCR鑒定

質粒提取按照OMEGA公司的質粒提取試劑盒操作步驟進行。菌落PCR以SP6（5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3）'、T7（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3）'為引物。

（6）DNA測序

將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大基因測序。通過GenBank數據做相似性分析。

1.3.3 粗酶液酶學性質初步研究

酶反應最適溫度：將離心后的粗酶液稀釋至合適倍數，在不同溫度下與底物進行反應，溫度梯度設置為0、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，測定酶活，確定反應最適溫度。

酶的熱穩定性：將稀釋適當倍數的粗酶液分別在0、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保溫1 h，40℃條件下測定剩余酶活。

酶反應最適pH：用不同pH的緩沖液分別配制pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的1%酪蛋白溶液作為底物，用相應pH的緩沖液稀釋酶液測定酶活。

酶反應pH穩定性：將酶液用相應pH的緩沖液稀釋至適當倍數，在4℃下放置20 h，40℃條件下測定剩余酶活。

各種金屬離子和化合物對酶活的影響：在反應體系中分別加入乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Mg2+、Ca2+、Na+、Zn2+、Fe2+、K+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Tween-20、Tween-80、Triten X-100，使反應體系中離子濃度達到2 μmol/mL，測定酶活。

2 結果與分析

2.1 低溫條件下產蛋白酶菌株篩選

復篩過程中粗酶液酶活＞50 U/mL的菌株見表1，由表1可知，菌株LS20-2的酶活最高，達到202.2 U/mL，且發酵過程中有特殊香味，因此確定菌株LS20-2為出發菌株，進行下一步的菌株鑒定及酶學性質研究。

表1 低溫下產蛋白酶菌株篩選結果Table 1 Screening results of protease-producing strain atlow temperature

2.2 菌種鑒定

2.2.1 生理生化特征

菌株LS20-2為革蘭氏染色，結果為革蘭氏陽性菌。參照《常見細菌系統鑒定手冊》，對菌株LS20-2進行生理生化鑒定試驗，結果如表2所示。由表2可知，菌株LS20-2能水解酪蛋白、明膠、淀粉，使硝酸鹽還原。

表2 菌株LS20-2生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain LS20-2

2.2.2 分子生物學鑒定

以菌株LS20-2基因組DNA為模板進行克隆測序。經PCR擴增后，結果見圖1。由圖1可知，該菌株16S rDNA片段長約1 500 bp，根據所得到序列在ezbiocloud網站上進行序列比對分析，選擇相關的參考菌株序列，進行聚類分析，構建系統發育樹，結果見圖2。

圖1 菌株LS20-2 16S rDNA PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA of strain LS20-2

圖2 菌株LS20-2 16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LS20-2 based on 16S rRNA sequences

由圖2可知，菌株LS20-2與Paenibacillus peoriaeDSM 8320在同一分支，序列相似性為99.66%。綜合菌株的形態特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系統進化樹的結果，可以將分離菌株LS20-2鑒定為皮氏類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae）。

2.3 菌株LS20-2產蛋白酶性質研究

2.3.1 溫度對酶活力影響及酶的熱穩定性研究

分別在不同溫度梯度進行酶促反應，測定蛋白酶的活力。以活性最大值為100%，溫度對蛋白酶相對酶活的影響結果如圖3所示。由圖3可知，該蛋白酶最適反應溫度為40℃，0～40℃時，酶活隨溫度的升高而穩步上升，溫度高于50℃后，酶活迅速降低，60℃時僅有最高酶活的30.7%。

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on enzyme activity

將上述制備的稀釋酶液分別在不同溫度梯度下水浴保溫1 h，放入冰水混合物中，與未被保溫處理的酶活力相比較，測定蛋白酶剩余活力。菌株LS20-2所產蛋白酶的熱穩定性如圖4所示，蛋白酶在0～40℃內活力穩定，高于50℃后迅速失活，50℃保溫1 h后僅剩原活性的26.1%，80℃處理1 h后，活性僅為原活性的5.6%。

圖4 溫度對酶的穩定性影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme stability

2.3.2 pH對酶活力的影響及pH穩定性研究

配制pH 3.0（檸檬酸-檸檬酸鈉）、pH 5.0（檸檬酸-檸檬酸鈉）、pH 7.0（磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉）、pH 9.0（甘氨酸-氫氧化鈉）、pH 11.0（碳酸鈉-氫氧化鈉）緩沖液，分別用緩沖液配不同pH的1%酪蛋白溶液作為底物，測定蛋白酶酶活。

pH對蛋白酶相對酶活的影響結果見圖5。由圖5可知，在酸性條件下，蛋白酶的相對活性僅為2.6%～8.1%，當pH＞5.0以后，酶活迅速升高，pH 7.0時酶活達到最高值，說明酶最適反應pH為7.0；在pH7.0～9.0蛋白酶表現出較高活力，反應pH＞9.0后緩慢下降，當反應pH至11.0時還有47.7%酶活。

將酶液用不同pH的緩沖液稀釋，4℃保存20 h后，測定剩余酶活力，結果見圖6。由圖6可知，酶液在pH5.0～7.0條件下保持穩定，處理后仍保持98%以上酶活，屬于中性蛋白酶。

圖5 pH值對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

圖6 pH值對酶的穩定性影響Fig.6 Effect of pH on enzyme stability

2.3.3 各種金屬離子和化合物對酶活的影響

在酶反應最佳溫度和最佳pH條件下，于反應體系中加入不同抑制劑，使反應體系中離子濃度達到2 μmol/mL，以未加抑制劑的酶活力為對照100%，不同金屬離子對酶解液相對酶活的影響結果見圖7。由圖7可知，各種金屬離子對酶活的影響存在差異，Mn2+、Tween-80、Tween-20對酶活有明顯的激活作用，相對酶活分別達到134.6%、127.1%和115.4%；Zn2+、Fe2+、Triten X-100對酶活有抑制作用，其中以Zn2+的抑制作用最強，相對酶活降至78%，Mg2+、EDTA、Na+、Ca2+、K+、Cu2+、Co2+對酶活影響不大。

圖7 金屬離子對酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ion on enzyme activity

3 結論

本研究從拉薩郊區小麥根際土壤中篩選出的產蛋白酶菌株LS20-2，經初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae）。通過對發酵液進行酶學性質初步研究，結果表明：該蛋白酶的最適反應pH為7.0，最適溫度為40℃。在pH 5.0～7.0，溫度0～40 ℃時酶活穩定，金屬離子Fe2+、Zn2+及Triten X-100能抑制蛋白酶活性，金屬離子Mn2+及表面活性劑Tween-20、Tween-80能提高蛋白酶活性。

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