壇裝黃酒貯存過程中污染微生物的分離鑒定

李 慧，陳歷水*，劉 洋，何 景，劉 蕾，張連慧，楊海鶯

（中糧營養(yǎng)健康研究院 老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209）

黃酒是以稻米、黍米等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒。釀造黃酒煎酒灌壇后，要經(jīng)過一定時間的貯存，以增加香氣和提高酒的醇厚感、協(xié)調(diào)性和增加酒體的穩(wěn)定性[1]。

由于黃酒是多菌種參與的開放式釀造低度酒，富含營養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸，是微生物的良好培養(yǎng)基，因此，貯存期成為了污染微生物繁殖的最佳時期[2]。尤其在黃酒生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)工具及貯藏容器消毒不過關，生產(chǎn)原料、生產(chǎn)用水微生物污染，煎酒工藝處理不徹底，貯藏環(huán)境控制不嚴格，貯藏時發(fā)生漏壇等都可以造成污染菌的引入[3-4]。

造成黃酒陳釀變質(zhì)的污染微生物，包括芽孢菌、霉菌、酵母、乳酸菌及其他細菌[5]，這些污染菌對黃酒的品質(zhì)及安全將會造成嚴重影響。謝廣發(fā)等[6]對酸敗袋裝黃酒中污染微生物進行檢測和分析，確認污染菌主要有假單胞菌屬，占總克隆數(shù)的92.3%，其次為無色桿菌屬，占總克隆數(shù)的7.7%。TERASAKI M等[7]也在日本清酒中分離出假單胞菌屬細菌。章銀珠等[8]從變質(zhì)傳統(tǒng)發(fā)酵陳化黃酒中分離了5株乳酸桿菌，4株酵母（分別是酵母屬、漢遜氏酵母屬、球擬酵母屬和畢赤酵母屬）和4株霉菌（分別是1株曲霉、2株青霉和1株側(cè)孢霉），這些微生物是引起陳化黃酒變質(zhì)的主要原因。KIM S A等[9]在韓國米酒中分離出蠟樣芽孢桿菌，認為污染了這種條件致病菌的米酒具有潛在的食品安全風險。章志超等[10]利用形態(tài)學觀察、生理生化和分子生物學手段從酸敗黃酒中分離出食果糖乳桿菌，為評估黃酒酸敗嚴重程度及解決相關食品安全問題提供了參考方法。

本研究針對性的選擇并優(yōu)化分離條件，采用形態(tài)學觀察、生理生化鑒定和分子生物學法對分離純化的污染微生物進行菌種鑒定，以期為有效控制或者降低壇酒霉變的概率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黃酒及黃酒污染物樣品：浙江某酒廠倉庫貯藏壇酒（壇外表面有明顯污染）。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、細菌芽孢染色液：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

1.1.3 化學試劑

酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒（DP307）、細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、Taq酶（5 U/μL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；引物：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成；VITEC GN卡、GP卡、YST卡、API 50 CHB/E試劑盒：法國梅里埃公司。

1.2 儀器與設備

IPP260低溫培養(yǎng)箱：德國Memmert公司；ATBTM New ATB自動微生物鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)：法國梅里埃公司；Scope A1正置相差顯微鏡：德國ZEISS公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO公司；Mini-Beadbeater-16研磨珠均質(zhì)器：美國Biospec公司；Veriti梯度PCR儀：美國LifeTechnologies公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher公司；XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 污染菌種的分離和純化

將黃酒10倍梯度稀釋至10-6。另取壇底沉淀物25 g，置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液，然后將此樣品進行10倍梯度稀釋至10-6。取各梯度稀釋樣品勻液1 mL于無菌平板中，將15～20 mL冷卻至46℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)3～5d。營養(yǎng)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別需氧和厭氧培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌落生長形態(tài)，大小及顏色的不同，挑選不同的單菌落接種于相應的固體培養(yǎng)基中進行純化，直至得到單一微生物。

1.3.2 形態(tài)學觀察

將分離得到的細菌分別在營養(yǎng)瓊脂、MRS瓊脂、MC瓊脂上進行劃線，于37℃條件下需氧和厭氧培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將分離得到的真菌在PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基上三點接種，于28℃條件下培養(yǎng)3～5 d后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)并鏡檢。

1.3.3 生理生化鑒定

細菌：挑取平板的單菌落，使用法國生物梅里埃公司VITECGN卡、GP卡，芽孢菌鑒定使用API50 CHB/E進行直接鑒定。

真菌：酵母樣真菌使用法國生物梅里埃公司YST卡進行鑒定。

1.3.4 分子生物學鑒定

（1）細菌的分子生物學鑒定

挑取細菌平板和乳酸菌平板上的單菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中，37℃過夜。取1 mL菌液12000r/min離心10min后，棄去上清，按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

16S rDNA序列擴增所用引物，正向引物為27F：5′-AG AGCCTGGCTCAGTTTGAT-3′；反向引物為1492R：5′-GG TTACCTTGTTACGACTT-3′[11-12]。

PCR反應體系（30μL）：ddH2O 19.2μL、10×Buffer3 μL、dNTPs 2.5 μL、引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL、所提取的基因組2 μL。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測。

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進行測序，獲得16S rRNA基因序列。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對。

（2）真菌的分子生物學鑒定

挑取絲狀真菌平板上的菌絲于20 mL的PDA液體培養(yǎng)基，在28℃恒溫搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，按照酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

擴增所用引物序列參照李慧等[13-14]的研究（見表1）。PCR反應體系和PCR反應條件同方法1.3.4，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 真菌基因擴增引物序列Table 1 Primer sequence of fungi gene amplification

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進行測序，獲得18S rRNA和ITS基因序列。測序結(jié)果在NCBI的GenBank中進行BLAST分析比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的鑒定

2.1.1 細菌的菌落及菌體形態(tài)分析

通過對污染黃酒及其沉淀物中的細菌進行分離、簡單形態(tài)學比對后得到3株不同形態(tài)的細菌，依次編號為B001、B002和B003。其中菌株B001和B002在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上（36±1）℃需氧培養(yǎng)48 h后，菌株B001的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)分別見圖1中的001-1、001-2，菌落呈乳白色、圓形、扁平、不透明、邊緣不整齊，有芽孢，芽孢橢圓形；菌株B002的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見圖1中的002-1、002-2，培養(yǎng)24 h時，菌落藍綠色圓形，培養(yǎng)48 h后為乳白色，扁平，不透明，邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陰性，桿狀。菌株B003在MRS培養(yǎng)基上，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h后，菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見圖1中的003-1、003-2，菌落呈圓形、白色、凸起，表面光滑、濕潤，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性，球狀。

圖1 細菌的菌落及細胞形態(tài)Fig.1 Colonies and cell morphology of bacteria

2.1.2 細菌的生理生化鑒定結(jié)果

利用法國梅里埃VITEK微生物鑒定系統(tǒng)及API鑒定系統(tǒng)對菌株B001、B002和B003的生理生化特征進行鑒定，并與數(shù)據(jù)庫結(jié)果進行比對。其中菌株B001的生理生化鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，菌株B001生理生化鑒定試驗結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），鑒定百分率為88%。

表2 菌株B001的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B001

續(xù)表

菌株B002的生理生化鑒定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株B002可初步鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），鑒定百分率為97%。

表3 菌株B002的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B002

菌株B003的生理生化鑒定結(jié)果見表4。由表4可知，B003號菌生化鑒定試驗結(jié)果為假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），鑒定百分率為83%。

表4 菌株B003的生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 4 Results of physiological and biochemical identification tests of strain B003

2.1.3 細菌分子生物學鑒定

將菌株B001、B002、B003的16S rRNA基因序列與Gen-Bank內(nèi)已知菌株的相應序列進行比對，結(jié)果表明，3株菌分別與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的序列相似度達99%；與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的序列相似度達99%；與假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）的序列相似度達99%。

通過形態(tài)觀察、生理生化試驗并結(jié)合分子生物學鑒定菌株B001、B002、B003分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）。芽孢桿菌和假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）是糖化發(fā)酵曲中的菌，芽孢桿菌屬的細菌是麥曲中最主要的優(yōu)勢菌，明串珠菌為兼性厭氧菌，是僅次于芽孢桿菌的最主要優(yōu)勢菌，該類菌更適合在低氧壓下生長，這與TERASAKI M等[7，15]的研究結(jié)果一致。本研究從污染黃酒中還分離出銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），該屬污染菌可從原料、釀造水或環(huán)境中引入，尤其是釀造和生產(chǎn)用水[16]，這種污染菌會對酒的品質(zhì)、風味和安全造成影響，需嚴格控制，謝廣發(fā)等[6]采用分子生物學手段分析袋裝污染黃酒時，也發(fā)現(xiàn)主要污染菌是假單胞菌屬細菌。

2.2 真菌的鑒定

2.2.1 真菌的菌落、細胞形態(tài)觀察結(jié)果

從黃酒和污染物中分離、純化得到3株真菌，依次編號為F004、F005和F006。3株真菌在PDA培養(yǎng)基上（28±1）℃需氧培養(yǎng)3～5 d，菌株F004的菌落和細胞形態(tài)結(jié)果分別見圖2中的4-1、4-2，菌落乳白色、濕潤、質(zhì)地均勻、菌體單細胞，臘腸形。菌株F005的菌落和細胞形態(tài)分別見圖2中的5-1、5-2，菌落平坦，橄欖灰色，有輻射紋，菌絲有分支，孢子橢圓形。菌株F006的菌落和細胞形態(tài)分別見圖2中的6-1、6-2，菌平坦，絲絨狀，落英粉色，閉囊殼球形，子囊孢子圓形，具有典型的紅曲菌形態(tài)特征。

圖2 真菌的菌落及細胞形態(tài)Fig.2 Colonies and cell morphology of fungi

菌株F004的生化鑒定結(jié)果見表5。由表5可知，菌株F004的生化鑒定試驗結(jié)果為頭狀螺旋地霉（Saprochaetecapitate），鑒定百分率為92%。

表5 菌株F004的生理生化鑒定實驗結(jié)果Table 5 Results of physiological and biochemical identification tests of strain F004

續(xù)表

2.2.2 分子生物學鑒定

為了進一步確定真菌鑒定結(jié)果，將菌株F004的18SrRNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）的序列進行對比，結(jié)果表明二者相似度達98%，結(jié)合生理生化反應及形態(tài)學分析，將該菌株鑒定為頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）。Saprochaetecapitate是本研究首次從黃酒中分離到的污染真菌，之前相關報道僅在乳制品中分離鑒定出該污染菌[17]。

分別將菌株F005及菌株F006測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行ITS序列同源性比較，選取同源性≥99%的菌株序列，運用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株F005為爪哇正青霉（Eupenicillium javanicum）。菌株F006與紫紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）及煙色紅曲菌（Monascus fuliginosus）親緣關系比較接近，結(jié)合形態(tài)學分析，菌株F006很有可能是紫紅曲菌或紅色紅曲菌。由于黃酒釀造生產(chǎn)中會使用紅曲作為糖化發(fā)酵菌種，本研究將不再對這株菌進行更為深入的鑒定分析。

圖3 菌株F005（A）及F006（B）的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of strain F005(A)and strain F006(B)

3 結(jié)論

黃酒釀造后，一段時間的貯存是提升品質(zhì)、協(xié)調(diào)風味的必要途徑，但同時黃酒因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，成了部分微生物的良好培養(yǎng)基而容易被污染。在條件控制不當?shù)那闆r下，引入的污染微生物會嚴重影響黃酒的穩(wěn)定性及品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失甚至食品安全危害[18]。

本研究利用梯度稀釋法和劃線純化法對壇裝貯存黃酒關鍵污染微生物進行了分離純化，得到編號為B001、B002、B003的3株細菌和編號為F004、F005、F006的3株真菌。結(jié)合形態(tài)學特征觀察、生理生化鑒定和分子生物學鑒定的方法對分離得到的菌株進行鑒定，鑒定菌株B001、B002、B003分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）和假腸膜明串珠菌（Leuconostocpseudomesenteroides），菌株F004、F005分別為頭狀螺旋地霉（Saprochaete capitate）、爪哇正青霉（Eupenicillium javanicum），菌株F006具有紫紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）的形態(tài)特征，這為后期對這些菌株的控制提供了理論依據(jù)。

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