木薯酒發酵過程中的有機酸變化及對其品質的影響分析

張 婷，陳小偉，張 琪，張沙沙，薛淑龍，蔣立新，范昊安，程勇杰，姚 剛，于林凱，毛建衛，蔡海鶯*

（1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；3.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江 杭州 310023）

木薯（Manihot esculentaCrantz）又名南洋薯、樹薯，與甘薯、馬鈴薯并稱之為世界三大薯類。其原產地為美洲熱帶，19世紀20年代中國成功引入，目前廣泛分布于廣西、廣東和海南等地區。木薯富含礦物質、維生素、微量元素和大量碳水化合物，其中淀粉含量為10%～30%，蛋白質含量約為1%～2%，纖維素含量約為1%～2%，脂肪含量約為0.3%～4.3%[1-2]，因此其獲得“地下糧倉”之美譽。但木薯含有少量有毒物質——氰化物，需要有效的脫毒技術來降低甚至去除其毒性。SAKA J D K等[3]采用水浸法測定剝皮和未剝皮木薯塊根的總生氰糖苷減少量，結果發現剝皮后的木薯塊根總生氰糖苷去除率達到97.902%。甜木薯是木薯種類之一，其生氰糖苷含量極低，所以可供人安全食用，但它不耐貯藏，保質期較短，加工成發酵酒后卻易于保存。COLEHOUR A M等[4]發現了厄瓜多爾亞馬遜地區的本土人每天都食用木薯酒；黃發新等[5]以粗木薯粉為原料，以米曲霉作液化劑、黑曲霉作糖化劑及酒母作發酵劑釀造木薯白酒；古碧等[6]以非即食型食用的木薯全粉為原料加甜酒曲釀造風味獨特的甜酒。這些都有力說明釀造甜木薯酒具有可行性。甜木薯發酵酒是主要通過新鮮甜木薯加酒曲直接釀造而成的生物發酵產品，富有甜味或半甜味，其含有的營養成分和微量代謝物質與其發酵過程中產生的特殊風味物質密切相關。

在發酵過程中，甜木薯酒中的微生物通過代謝作用產生酸、醇、酯等香氣物質。其中有機酸是甜木薯酒的重要呈味物質，直接影響酒的口感品質。然而目前國內乃至國際上有關木薯酒的有機酸等方面研究少見報道。但其他甘薯酒的有機酸等方面研究較多，如HAN X等[7]以冀紫薯1號為原料釀造紫甘薯紅酒。研究結果表明，當料液比為1∶3（g∶mL），紫薯經液化、糖化和加酵母菌發酵，在23℃、pH 4.0的條件下發酵7 d后的紫甘薯紅酒中含有L-蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等9種有機酸。

本研究以新鮮甜木薯為原料，采用甜酒曲液化糖化、發酵成木薯酒的方法，對酒中還原糖含量、酒精度、pH值及總酸含量的變化趨勢進行研究，且利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析木薯酒發酵期間的主要有機酸種類及含量的動態變化，進而探討木薯酒酸味味道強度和味感特性。以期有利于木薯資源的開發和利用，并為木薯酒風味物質的相關研究奠定理論基礎，進一步促進酒業市場的繁榮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白肉甜木薯：海南省?？谑械哪臼砘兀粡V西香蜜甜酒粉：南寧廣龍工貿有限責任公司。

丙酮酸（純度98.0%）、琥珀酸（純度99.0%）、L-酒石酸（純度99.5%）：美國Sigma公司；草酸（純度≥98.0%）、L-蘋果酸（純度≥98.0%）、檸檬酸（純度≥98.0%）：中國食品藥品檢定研究院；乙酸（純度≥99.7%）、乳酸（純度≥98.0%）、磷酸二氫鉀（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：美國天地有限公司；磷酸（色譜純）：上海長哲生物科技有限公司。其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計：上海市元析儀器有限公司；Allegra X-12R冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；Waters e2695高效液相色譜：美國waters公司。

1.3 方法

1.3.1 木薯酒加工工藝流程及操作要點

新鮮甜木薯→清洗→去皮→切片→蒸煮→冷卻→加水打漿→拌曲發酵→過濾→高溫殺菌→成品

操作要點：新鮮甜木薯原料要求無蟲害、無霉變，清洗干凈，削皮，切成8～10 mm厚度的塊狀，常壓蒸煮至熟而不爛，蒸煮后冷卻至常溫，加水進行打漿，配制成50%熟木薯打漿液，再以550∶0.5的質量比例放入甜酒曲并攪拌，嚴格控制發酵溫度為30℃，發酵時間為84 h，每12 h取3個平行酒樣，且酒樣于10 000 r/min條件下離心20 min，取上層清液置于-85℃超低溫冰箱儲存，待測其還原糖、酒精度、pH、總酸及有機酸含量。發酵期間，前2 d微生物生長旺盛，產生大量的CO2，應及時排氣。以木薯酒中還原糖含量和酒精度不再變化時，結束發酵。

1.3.2 分析檢測

木薯酒的還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[8]；酒精度的測定采用國標GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》；pH值：pH值測定采用酸度計；總酸含量的測定采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示劑法；有機酸含量的測定采用高效液相色譜法，具體色譜條件如下：Agilent TC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B 0.02 mo1/L KH2PO4溶液（用H3PO4調pH至2.7），且流動相A/B（2∶98，V/V）；液相條件為等梯度洗脫20 min，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為210 nm。

準確稱取丙酮酸標準品15.000 mg，用超純水溶解并定容到10 mL容量瓶中，搖勻，配制1.5 mg/mL的丙酮酸標準溶液。以相同的方法依次配制草酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸與琥珀酸的標準溶液。然后將以上各標準溶液配制混標，4℃冷藏保存。以混標質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制有機酸標準曲線，按照有機酸出峰時間及標準曲線回歸方程分別對樣品中的有機酸進行定性定量分析。

1.3.3 數據統計與分析

實驗中的檢測分析包括木薯酒的還原糖、酒精度、pH、總酸和有機酸種類及含量。所有線性方程、重復性和準確性實驗的樣品數據均由Excel 2010計算得出，樣品處理后的所有數據均以平均值±標準差的形式表示，且每個數據點3個重復，并用Origin86與SPSS16.0軟件對所有數據進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中還原糖變化規律

酒糖度可反映其甜味，發酵過程中的酒甜味變化對口感會產生一定的影響。香蜜甜酒曲含有根霉和酵母兩種微生物。由于微生物能利用的可發酵性糖大都是還原糖和低聚糖，木薯酒中還原糖含量變化過程如圖1所示。

圖1 不同發酵時間的木薯酒還原糖含量變化Fig.1 Changes of reducing sugar contents in cassava wine at different fermentation time

在發酵過程中，復雜碳水化合物降解產生的還原糖不僅能給予酒甜味，同時也是微生物的營養物質。從圖1可看出，發酵24 h期間，酒中的還原糖含量隨發酵時間延長而快速增加，24 h時達到還原糖含量的最高峰。發酵24 h后的還原糖含量先快速下降后降低趨緩，最終減少至54.67 mg/mL。與LUO H等[9]研究白酒中的微生物生態因子動力學的結果相似。結果表明，發酵前期，由于霉菌的糖化作用極為旺盛，白酒中的還原糖含量一直上升。隨著發酵進行，酵母菌等微生物繁殖速率較快，消耗大量還原糖，使還原糖又呈下降趨勢。因此木薯酒中還原糖的降低，可能由于產酸菌、產酯菌等微生物將可發酵性的糖類用于自身生長及代謝。但木薯酒中的糖分并非全部轉化為酒精，總有一部分糖殘留，給予酒體甜潤和稠厚感。

2.2 發酵過程中酒精度變化規律

酒中的醇類物質是由霉菌、酵母和細菌等微生物利用糖、氨基酸及脂肪等成分而生成的主要代謝產物，包括一元醇、多元醇和芳香醇[10]。其中酒精是酒發酵的主要產物，其生成量的多少是鑒定出酒質量的主要指標，也是判斷發酵是否正常的重要依據。木薯酒中酒精度變化過程如圖2所示。

由圖2可知，在發酵前12 h，木薯酒中酒精度增長緩慢，在發酵12～36 h時迅速上升。這主要由于在發酵初期，微生物的增殖速率較慢，對酒中可發酵性糖類的利用率較低。隨著發酵進行，酒中的可發酵性糖濃度升高，使微生物能利用糖類進行酒精發酵，從而產生大量酒精。但在后發酵期間，酒中還原糖含量逐漸減少，再加上發酵產物酒精抑制微生物的增殖，所以酒精度在36～84 h先緩慢上升后平穩在7.11%vol。說明大量微生物在發酵60～84 h處于衰老階段，此時發酵基本結束。

圖2 不同發酵時間的木薯酒酒精度變化Fig.2 Changes of alcohol contents in cassava wine at different fermentation time

2.3 發酵過程中pH值與總酸含量的變化規律

酒pH值與總酸含量有密切的聯系，且總酸含量可反映其酸味，發酵過程中的木薯酒酸度變化也會對口感產生一定的影響。根霉能產生糖化酶，將淀粉水解成還原糖及低聚糖類等以及少量的有機酸[11-12]。在厭氧環境下，酵母菌利用根霉糖化淀粉所產生的糖類酵解為酒精和酸[12]。木薯酒的pH值及總酸含量變化過程如圖3所示。

圖3 不同發酵時間木薯酒pH值與總酸含量變化Fig.3 Changes of pH and total acid contents in cassava wine at different fermentation time

由圖3可知，在0～84 h的發酵過程中，木薯酒的總酸趨勢先緩慢降低再緩慢增加，后快速增加，與pH值變化趨勢相反。可能因為發酵初期微生物繁殖所需能源和碳源物質不足，導致有機酸被消耗利用。到12 h后的木薯酒中微生物增殖速率快，從而產生有機酸。發酵后期發酵產生的酒精又被氧化成有機酸，從而引起總酸含量的增加。因此，在發酵過程中應控制微生物的代謝作用，調節總酸的生成量，保證木薯酒產品的質量穩定。

2.4 發酵過程中的有機酸組分及含量分析

2.4.1 有機酸標準曲線

按照色譜條件，8種有機酸的分離效果較好（見圖4）。以各標準有機酸質量濃度（x）對峰面積（y）進行線性回歸，結果見表1。由表1可知，各有機酸標準曲線相關系數R2均≥0.996，表明二者線性關系良好。

圖4 有機酸混合標準品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards

表1 8種有機酸標準品標準曲線回歸分析Table 1 Regression analysis of standard curves of eight organic acids standards

2.4.2 發酵前后的有機酸組分和含量分析

傳統木薯酒的有機酸部分來源于木薯本身，另一部分來源于酒精發酵、乙酸或蘋果酸-乳酸發酵。通過HPLC對酒發酵期間包括乳酸、乙酸、檸檬酸在內的8種有機酸進行分析，采用外標法測定其有機酸種類及含量，其動態變化的研究結果見表2。

表2 木薯酒發酵過程中的有機酸組成及動態變化Table 2 Composition and dynamic changes of organic acids in fermentation process of cassava wine mg/mL

木薯原料的成熟程度會引起酒的有機酸組成和含量變化。通常有機酸是在木薯生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環等呼吸基質以及糖原異生作用基質而被消耗[13]。從表2可看出，乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸是新鮮木薯的主體有機酸，其中乳酸含量最高。與李姍姍等[14]的研究結果類似，從木薯塊根經乙醇提取后的化學物質的波譜分析表明：木薯塊根含有乳酸和琥珀酸。PICHADH等[15]采用HPLC分析生、熟甘薯塊根中的有機酸，研究表明生、熟甘薯有機酸均以蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸為主，少量含有草酸。

發酵過程中微生物的代謝也會引起酒的有機酸組成和含量變化。表2結果表明，木薯酒有機酸種類豐富，且隨著發酵菌種生長與代謝而發生改變。在發酵期間，酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸是木薯酒中有機酸的重要組成部分，其中主要有機酸為乳酸，這可能是由于木薯酒在發酵過程中以同型或異型乳酸發酵為主，大部分葡萄糖轉化為乳酸的結果[16]。草酸、丙酮酸、蘋果酸等含量相對較少，是酒中的輔助酸味有機酸，這形成了傳統木薯酒豐富的酸味味感。發酵后期木薯酒中的蘋果酸含量逐漸降低，可能因為酒通過三羧酸循環合成，產生蘋果酸、檸檬酸，蘋果酸通過蘋果酸-乳酸發酵又被轉化成酒精或乳酸。與趙鶴然[17]研究葡萄酒發酵過程中的蘋果酸變化結果一致。DRIEHUIS F等[18]發現乳酸菌在厭氧條件下具有降解乳酸轉化為乙酸的能力。而乙酸是木薯酒中揮發性有機酸的主要成分，含量少時帶有愉快的醋香味。木薯中的谷氨酸由于其降解代謝，使木薯酒中的琥珀酸積累。TSUJI A等[19]研究表明丙酮酸、檸檬酸及琥珀酸是碳代謝的中心物質。

2.5 有機酸的酸味特性分析

酒中有機酸的種類、含量及構成受原料、酒曲、釀造條件等多種因素影響[20]，對酒的風味有很大影響。酒利用酒曲中的微生物進行恒溫發酵，會產生多種酸味物質，但對酸味起主要作用的是酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸。代謝產物乳酸、乙酸等有機酸對木薯酒的風味影響顯著，且比例協調地抑制酒發酵過程中的雜菌生長，增強酒的醇厚感，促進芳香酯的形成。基于酸的濃度和酸味之間并不呈現一種簡單的相互關系[21]，本研究參考酒類產品有機酸的閾值[22-23]（見表3）并結合味道強度值taste active value，TAV）（TAV值為樣品中呈味有機酸在樣品中的含量與其對應的呈味閾值之比。）分析法對木薯酒中呈味有機酸的呈味貢獻進行分析不同發酵時間的樣品各呈味有機酸TAV分析見表4。

表3 7種呈味有機酸閾值與酸味特性Table 3 Threshold value and sour taste characteristics of seven kinds of taste organic acids

表4 不同發酵時間的有機酸味道強度值分析Table 4 TAV analysis of organic acids with different fermentation time

不同有機酸對酒中風味貢獻不同。由表4可知，在發酵期間，酒中丙酮酸的TAV值始終＜0.5，風味不顯著；TAV值＞2的是乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸，表明乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸是影響傳統木薯酒口感的重要有機酸。酒石酸、蘋果酸作為酒的輔助酸味特征成分。

發酵84h的木薯酒有最高的味道強度，發酵12h樣品最低。影響木薯酒酸味特性的主要是乳酸和乙酸，還有獨特的檸檬酸。在發酵期間，木薯酒中的七種呈味有機酸總含量變化與總味道強度變化趨勢一致，其中乳酸的含量變化趨勢也與之一樣，這說明發酵過程中各有機酸的消長影響酒的味道強度，尤其乳酸的消長。雖然TAV值這一概念沒有考慮到某些成分的協同作用或抵消作用對酒中風味的影響，仍有一定的局限性，但TAV值仍不失為釀造者評價其產品和生產方法的有用參考依據[23]。

2.6 統計分析

2.6.1 相關性分析

對不同發酵時間的木薯酒各呈味有機酸量之間，呈味有機酸量與總味道強度進行Pearson法相關分析，結果見表5。由表5可知，乳酸與乙酸變化呈顯著正相關（P＜0.01），琥珀酸與酒石酸變化具有顯著的負相關（P＜0.05），總味道強度與乳酸、乙酸變化呈顯著正相關（P＜0.05）。

表5 發酵過程中的各呈味有機酸與總味道強度的相關性分析Table 5 Correlation analysis of taste organic acids and total taste intensity during fermentation process

2.6.2 聚類分析

對不同發酵時間的木薯酒各呈味有機酸味感貢獻進行聚類分析，結果見圖5。由圖5可知，其中1～6分別代表發酵時間為0、12 h、24 h、36 h、60 h和84 h。根據發酵時間，可以將呈味有機酸聚類為3類。即第1類：0、12 h，第2類：24 h、36 h，第3類：60 h、84 h。聚類分析的結果代表著在不同發酵時間，呈味有機酸量及總味感強度的變化趨勢一致，皆是先緩慢增加，后快速增加再呈趨緩的總趨勢。

圖5 發酵不同時間的各呈味有機酸與總味道強度的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of taste organic acids and total taste intensity with different fermentation time

3 結論

本研究以新鮮甜木薯為原料，經香蜜甜酒曲通過短時間發酵而釀造木薯酒產品，對發酵過程中酒品質進行動態跟蹤及分析。研究發現：在發酵期間，木薯酒還原糖先快速增加至最高點然后降低趨緩，最終減少至54.67 mg/mL。酒精度先上升后平穩在7.11%vol。總酸含量先緩慢降低至2.21 mg/mL，再緩慢上升，后快速上升，與pH值變化趨勢相反。本研究通過甜酒曲發酵木薯酒的品質分析，為木薯酒的釀造、加工提供一定的參考價值。

本研究采用HPLC分析木薯酒發酵期間的有機酸。研究表明：乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸是新鮮木薯的主體有機酸，其中乳酸含量最高，達到1.925 mg/mL。在發酵期間，酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸是木薯酒中有機酸的重要組成部分，分別占木薯酒總有機酸含量的2.664%～12.306%，41.503%～63.527%，18.208%～23.819%，1.220%～27.766%，3.165%～15.889%，草酸、丙酮酸、蘋果酸等含量相對較少，是酒中的輔助酸味特征成分，這形成了木薯酒豐富的酸味味感。在酸味味感強度分析中，乳酸和乙酸是木薯酒的主體酸，發酵期間其TAV值占總TAV值為65.824%～95.835%，影響酒的酸味特性，賦予木薯酒一定的酸味。其中發酵84 h的木薯酒有最高的TAV值，其可達到223.865。本研究為進一步開發發酵酒功能性產品提供實驗依據。

本研究通過木薯酒發酵過程中還原糖、酒精度、pH值、總酸及有機酸等動態變化，以把握發酵過程中主要有機酸的演變規律，為木薯酒品質影響的研究奠定基礎。后續的研究應對酒中香氣成分、多酚物質的變化規律進行分析，進一步研究木薯酒的香品質與抗氧化特性變化，最終實現發酵木薯酒的現代化生產工藝。

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