羅漢果內生菌中產環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的篩選及產酶條件優化

張昌志，范彩琴，龍楚媚，付 強，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

羅漢果（Siraitia grosvenori）是我國特有珍貴藥用和甜料植物，為葫蘆科多年生藤本植物，主要分布于廣西北部山區，具有潤腸通便[1]、抗氧化[2]、抗癌[3]、免疫調節[4]、降血糖[5]、止咳祛痰[6]等功效。近年來羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷VI、羅漢果苷V等11種苷成分已在羅漢果的果實中提取獲得[7]。羅漢果苷都具有相似的苷元，都以羅漢果醇為苷元骨架，葡萄糖為糖基供體，不同之處在于C3和C24位置上所連的葡萄糖基團的數目和連接方式。李典鵬等[8]利用薄層色譜分析，研究發現苦味的苷IIE、苷III主要存在于果齡30 d果實中，30 d和40 d分別發現了苷III、IV，甜苷V直到70d時才出現且在85d其含量才達到最高，反映出了隨著果實的成熟苦苷轉化為甜苷。TANG Q等[9]報道，50～70 d甜苷V急劇積累期，果實中調控羅漢果苷元糖基化的二磷酸尿核苷葡萄糖基轉移酶（uridinediphosphateglucosyltransferase，UGT）基因表達水平大幅上調，說明羅漢果隨著果實的成熟苦苷轉化為甜苷的過程中，葡萄糖基轉移酶發揮著重要的作用，也說明羅漢果中含有葡萄糖基轉移酶。

到目前為止，在世界各地陸續發現了可以產環糊精葡萄糖基轉移酶（cyclodextrin glucosyltransferase，CGTase）的菌株，根據采樣地點的不同特性一般可分為兩種，一種是從極端環境取樣，如堿性土壤[10]、沙土[11]、海洋、湖泊[12]、火山、油井等。第二種是從底物富集地取樣，從含高濃度淀粉的土壤中分離篩選目的菌株，如玉米[13]、木薯[14]、大豆、土豆、甘蔗、黃豆、南瓜等的種植地[15]以及淀粉工廠原料廢物[16-17]。本研究從羅漢果內生菌入手，從中篩選出高產環糊精葡萄糖基轉移酶的菌株進行鑒定，在此基礎上，采用單因素和正交試驗方法對該內生菌的產酶發酵條件進行優化，以期利用CGTase酶法改性羅漢果苦味苷、改變羅漢果苦味皂苷上葡萄糖基團數目、從根本上解決苦果和苦苷的有效利用等問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

羅漢果：2015年10月采自廣西桂林市龍勝縣；編號為ND-3、ND-6、ND-10、NR-1、NR-4菌株均分離自健康羅漢果。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：稱取已去皮馬鈴薯200 g，切塊，煮30 min，四層紗布過濾，加入蔗糖20 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L，pH自然，121℃滅菌25 min。

篩選培養基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

種子培養基：可溶性淀粉10 L，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

基礎發酵培養基[18]：可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO40.2 g，MgSO·47H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，自然pH值，121℃滅菌15 min。

1.1.3 化學試劑

次氯酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；酚酞、甲基橙（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；馬鈴薯淀粉（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養箱：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；SY100型顯微鏡：日本Nikon公司；UV mini-1240型紫外分光光度計：日本島津公司；Epoch2微孔板分光光度計：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內生菌的分離純化

按參考文獻[19]中的方法對羅漢果的根、莖、果進行消毒，對已消毒的羅漢果根、莖、果進行剪切后，接種到PDA培養基上，分別置于28℃培養，定期觀察生長情況。待組織周圍長出菌落后，再進行分離純化得到羅漢果的內生菌。

1.3.2 產環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的初篩

將方法1.3.1得到的羅漢果內生菌分別接種于篩選培養基上，培養一段時間后，發現部分菌株在甲基橙和酚酞背景下的平板內出現淡黃色且近無色的斑點，究其原因在于酚酞在環糊精的疏水空腔內會形成無色的二價陰離子[18，20]。挑出有黃色透明圈的菌株于種子培養基中發酵培養，按4%（V/V）接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL的基礎發酵培養基中，于30℃、160 r/min條件下培養72 h。經5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取200 μL粗酶液滴加至已打孔（d=1 cm）的篩選培養基平板上，40℃水浴2 h，測量黃色透明圈直徑大小。挑選出黃色透明圈大的菌株進行復篩。

1.3.3 產環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的復篩

粗酶液的制備：按照4%接種量將初篩菌株接種于裝液量為50mL/250mL的基礎發酵培養基中，于30℃、160r/min條件下培養72h。經5000r/min離心10min，上清液為粗酶液。

酶活定義：單位時間內使吸光度值下降10%的酶量定義為一個酶活單位（U/mL）。

酶活的測定[21]：取10 μL適當稀釋的初篩菌株的粗酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0）0.2 mL，再加入0.2%馬鈴薯淀粉0.2 mL，振蕩，于40℃水浴10 min后，立即加入0.5 mol/L的醋酸0.5 mL，終止反應，然后加入0.005%碘液顯色。同時以蒸餾水為空白，以不加酶液為對照，在波長700 nm處測定吸光度值。酶活計算公式如下：

式中：a為對照組的吸光度值；b為樣品的吸光度值。

1.3.4 環糊精葡萄糖基轉移酶產生菌的鑒定

選取復篩中酶活性高且穩定的菌株進行菌種鑒定。

（1）形態學鑒定。將菌株劃線于PDA培養基上，37℃培養12～24 h，觀察菌落形狀、大小、表面光滑度、培養基顏色，并進行革蘭氏染色和芽孢染色[22]，觀察菌株細胞形態。

（2）分子生物學鑒定。將菌株送武漢華大基因科技有限公司，完成16SrDNA測序，將該菌株的16S rDNA序列在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行BLAST同源搜索，應用MEGA軟件進行序列比對分析，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.3.5 單因素試驗優化產酶條件

對復篩中選取的產酶菌株進行產酶單因素發酵條件研究。基本產酶發酵條件：1%的碳源、0.5%的氮源，pH自然，按4%的接種量將種子液接入裝液量為50 mL/250 mL的基礎發酵培養基中，于30℃、160 r/min條件下發酵72 h，考察不同單因素對菌株產酶的影響。

碳源種類及添加量的確定：在基本產酶發酵條件下，分別添加1.0%可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、環糊精、葡萄糖和乳糖代替基礎發酵培養基中的碳源，考察碳源對菌株產酶的影響。然后再選擇最佳碳源，設置其添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察碳源添加量對菌株產酶的影響。

氮源種類及添加量的確定：依據基本產酶發酵條件，在碳源研究的基礎上，分別添加0.5%蛋白胨、尿素、干酪素、硫酸銨和檸檬酸銨代替基礎發酵培養基中的氮源，考察氮源對菌株產酶的影響。然后再選擇最佳氮源，設置其添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，考察氮源添加量對菌株產酶的影響。

初始pH值的確定：考察初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時對菌株產酶的影響。

發酵溫度的確定：考察發酵溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃時對菌株產酶的影響。

裝液量的確定：考察裝液量分別為50mL/250mL、70mL/250 mL、90 mL/250 mL、110 mL/250 mL、130 mL/250 mL時對菌株產酶的影響。

1.3.6 正交試驗優化產酶條件

在單因素研究的基礎上，根據單因素試驗結果，固定對試驗結果影響不大的因素，選擇對試驗結果影響大的因素，以CGTase酶活作為評價指標進行產酶條件優化[23-24]。

2 結果與分析

2.1 產環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的初篩結果

通過初篩從羅漢果內生菌中篩選獲得11株CGTase產生菌，部分菌株酚酞甲基橙顯色結果如圖1所示。從中選出5株褪色明顯的內生菌進行復篩，分別在對數期（36 h）和穩定期（72 h）對酶活進行測定，結果見表1。

圖1 5株內生菌酚酞甲基橙褪色結果Fig.1 Phenolphthalein methyl orange discoloration results of 5 strains of endophytic bacteria

表1 產CGTase菌株的篩選結果Table 1 Screening results of CGTase-producing strains

由表1可知，在培養36 h進行酶活測定時，不同菌株的酶活力相差較大，但在培養72 h后，測得5株菌株都有較強的酶活。說明菌株在對數期時生長活躍，但產酶較少，產酶主要在穩定期。在72 h時測定菌株ND-6酶活最高為6 831 U/mL，菌株NR-4酶活較低為4 012U/mL；綜合考慮產酶活力，選擇產CGTase快且酶活高的菌株ND-6進行后續試驗。

2.2 菌株ND-6的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌株ND-6的菌落及細胞形態結果見圖2。由圖2a可知，在PDA培養基上，菌株ND-6菌落呈圓形，中間皺起，邊緣平整，略帶黃色。由圖2b可知，菌株在光學顯微鏡下呈桿狀，革蘭氏染色為陽性，有芽孢且位于菌體中間，初步得出該菌株屬于芽孢桿菌。

圖2 菌株ND-6的菌落(a)和細胞(b)形態Fig.2 Colony(a)and cell(b)morphology of strain ND-6

2.2.2 分子生物學鑒定

由武漢華大基因科技有限公司測得ND-6的16S rDNA基因序列堿基長度為1 445 bp，經過同源性序列檢索，結果顯示菌株ND-6與Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillussp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA 序列同源性高于99%。在搜索比對結果中選擇與菌株ND-6同源性較高的菌株，建立菌株ND-6的系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株ND-6與Bacillus amyloliquefaciens聚于一支，相似度最高。結合菌株ND-6的形態觀察結果和分子生物學鑒定結果，參照《常用細菌系統鑒定手冊》[25]，最終確定菌株ND-6為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 菌株ND-6基于16S rDNA序列建立的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ND-6 based on 16S rDNA sequences

2.3 單因素試驗結果分析

2.3.1 碳源種類及添加量的選擇

碳源種類對菌株ND-6產酶的影響結果見圖4。由圖4可知，環糊精最有利于菌株ND-6產酶，酶活達到6 947 U/mL；可溶性淀粉次之，酶活為6 736 U/mL，乳糖和葡萄糖再次之，酶活分別為6 631 U/mL和6 000 U/mL，馬鈴薯淀粉也能產酶，但產酶水平遠低于前述碳源，酶活只有1 894 U/mL。因此，選擇環糊精作為最佳碳源。

環糊精添加量對CGTase酶活影響結果見圖5。由圖5可知，隨著環糊精添加量的增加，CGTase酶活先增加后降低。當環糊精添加量為0.5%～1.0%時，隨著環糊精添加量的增加CGTase酶活增大；當環糊精添加量為1.0%時，酶活最高為6 852 U/mL；當環糊精添加量為1.0%～2.5%時酶活呈現下降趨勢。因此，選擇最佳環糊精添加量為1.0%。

圖4 不同碳源對CGTase酶活的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on CGTase activity

圖5 環糊精添加量對CGTase酶活的影響Fig.5 Effects of cyclodextrin addition on CGTase activity

2.3.2 氮源種類及添加量的選擇

氮源種類對菌株ND-6產酶的影響結果見圖6。由圖6可知，蛋白胨為氮源時，酶活最高為6 736 U/mL，且不同氮源對菌株產酶能力影響不一樣，說明氮源的選擇對產酶的影響十分重要。因此，選擇蛋白胨作為最佳產酶氮源。

圖6 不同氮源對CGTase酶活的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on CGTase activity

不同蛋白胨添加量對CGTase酶活影響結果見圖7。由圖7可知，CGTase酶活隨著蛋白胨添加量的增加先升高后降低。當蛋白胨添加量在0.25%～0.75%時，隨著蛋白胨添加量的增加CGTase酶活增大；當蛋白胨添加量在0.75%時，此時酶活最大為6 538 U/mL；當蛋白胨添加量在0.75%～1.25%時，CGTase酶活逐漸降低。因此選擇最佳蛋白胨的添加量為0.75%。

圖7 蛋白胨添加量對CGTase酶活的影響Fig.7 Effects of peptone addition on CGTase activity

2.3.3 裝液量的選擇

裝液量對菌株ND-6產酶的影響結果見圖8，由圖8可知，菌株產酶隨著裝液量的增加酶活呈現先升高后降低的趨勢，說明菌株產酶和生長需要一定的氧氣，菌株在裝液量為70 mL/250 mL時，酶活最高為5 684 U/mL。因此，選擇最佳裝液量為70 mL/250 mL。

圖8 不同裝液量對CGTase酶活的影響Fig.8 Effects of different loading volume on CGTase activity

2.3.4 培養基初始pH值的選擇

培養基初始pH值對菌株ND-6產酶的影響結果見圖9。

圖9 不同初始pH值對CGTase酶活的影響Fig.9 Effects of different initial pH value on CGTasee activity

由圖9可知，在菌株的發酵過程中，隨著培養基的初始pH值增加，CGTase活性先升高后降低，當培養基初始pH值為8.0時，酶活性最高為8 526 U/mL，這說明微堿性環境有利于菌株ND-6產酶。因此，選擇培養基最優初始pH值為8.0。

2.3.5 發酵溫度的選擇

發酵溫度對菌株生長及產酶有很大的影響，合適的溫度對發酵效率和產酶的積累都很重要。培養溫度對菌株ND-6產酶的影響結果見圖10。由圖10可知，菌株在25～50℃范圍內隨著溫度的增加酶活先升高后降低，產酶適宜范圍為40～50℃，且在45℃時具有最高的酶活力，酶活為9263U/mL。說明溫度為45℃時，適合菌株產酶。

圖10 不同發酵溫度對CGTase酶活的影響Fig.10 Effects of different fermentation temperatures on CGTase activity

2.4 正交試驗優化菌株ND-6的發酵條件

在單因素試驗的基礎上，固定裝液量為70mL/250mL，選擇環糊精（A）、蛋白胨（B）、初始pH值（C）、發酵溫度（D）為影響因素，CGTase酶活為考察指標，采用L9（34）正交設計研究不同因素對酶活的影響，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 產CGTase發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of CGTase-producing fermentation conditions

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，在菌株產酶的過程中，各因素對產酶的影響程度各不相同。根據極差大小R值得出影響菌株ND-6產酶強弱順序為D＞A＞B＞C，即初始pH值＞環糊精添加量＞蛋白胨添加量＞發酵溫度。由極差分析得出最佳產酶的條件為A2B3C1D2，即最佳培養條件為環糊精1.0%、蛋白胨1.0%、發酵溫度40℃、初始pH值8。

2.5 驗證試驗

利用優化后的培養基和培養條件對菌株ND-6重新發酵產酶，即以蛋白胨10 g，環糊精10 g，酵母提取物5 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2CO30.2 g，水定容至1 L，配制發酵液，調節初始pH值為8.0，接種量為4%，裝液量為70 mL/250 mL，40℃、160 r/min振蕩培養72 h，離心制備粗酶液，測得的CGTase酶活為9 753 U/mL。

3 結論

從羅漢果內生菌中篩選出了一株高產葡萄糖基轉移酶的菌株ND-6，經形態學和分子生物學鑒定其為一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通過單因素和正交試驗得出最優產酶發酵條件為環糊精1.0%作碳源、蛋白胨1.0%作氮源、發酵溫度40℃、初始pH值8.0，裝液量70 mL/250 mL。在此優化發酵條件下，測得發酵液中的CGTase酶活可達9 753 U/mL，CGTase酶活是優化前的1.43倍。

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