一株刺盤孢屬菌的分類鑒定及轉化孕酮和雄烯二酮的研究

張廣求，段焰青，馬慧宇，劉 赟，杜 剛*

（1.云南民族大學 電氣信息工程學院云南 昆明 650500；2.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650202；3.云南煙草質量監督檢測站，云南 昆明 650106；4.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會教育部重點實驗室，云南 昆明 650500）

甾體化合物又稱類固醇化合物，是含有環戊烷多氫菲核化合物的總稱，母核結構由三個六元環和一個五元環構成，甾體化合物隨母核上取代官能團和環上氧化狀態的差異，具有的特定的生理活性，常見的活性甾體類化合物包括性激素、腎上腺皮質激素、甾醇、膽汁酸、強心苷、甾體皂苷、甾體生物堿等[1]。

微生物轉化甾體化合物具較好的選擇性，在甾體藥物的研究和生產中有重要的地位[2]，一些微生物轉化過程已被成功地整合到甾體藥物和關鍵中間體的生產中[3-4]，甾體的微生物轉化類型包括羥基化、脫氧、氧化還原、環氧化等[5-7]。很多微生物菌株可實現甾體羥基化，如青霉菌、鏈霉菌、毛霉、曲霉、根霉、小克銀漢霉等[8-11]。刺盤孢屬菌株進行生物轉化已有很多研究，ARUNRATTIYAKORN P等[12]以刺盤孢屬菌株MAT02轉化α-倒捻子素，獲得新穎的轉化產物；NUMPAQUE M A等[13]以尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）轉化阿魏酸為4-乙烯基愈創木酚，產生香莢蘭乙酮、香草醛和乙基愈創木酚等香味物質，WU Y等[14-15]在微生物轉化甾體的研究中，亞麻刺盤孢菌株（Colletotrichum lini）ST-1可轉化4-雄烯二酮（4-androstenedione，4-AD）為11α,15α-二羥基-4-雄烯二酮，轉化孕酮為15α-羥基孕酮，轉化睪酮為11α,15α-二羥基睪酮。以上研究，可得到甾體化合物多樣化的衍生物，為甾體藥物篩選和生產提供了技術支持。

尋找新的甾體轉化菌株是甾體工業發展的重要課題，本研究從滇重樓根狀莖中分離到一株能轉化孕酮和4-AD的刺盤孢屬菌株YNCA0116，并對其進行分類鑒定和轉化研究，以期為研究和開發甾體藥物提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

轉化菌株為實驗室保藏菌株，分離自滇重樓根狀莖，菌株實驗室編號為YNCA0116。

1.1.2 試劑

孕酮和4-AD標準品（純度＞98%）：江蘇省鹽城信誼醫藥化工有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）試劑（瓊脂糖、DNATaq酶Mix、引物ITS4、ITS5等）：上海生工生物工程技術服務有限公司。其他試劑均為分析純：購自國藥化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基：蔗糖2.0%，馬鈴薯20.0%，瓊脂2.0%，pH自然。

種子培養基：蔗糖2.0%，馬鈴薯20.0%，pH自然。

孕酮或4-AD轉化培養基為察氏培養基：NaNO30.3%，K2HPO40.1%，KCl 0.005%，MgSO4·7H2O 0.05%，蔗糖2.0%，孕酮或4-AD 0.1%，吐溫-80 0.2%，pH自然。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ZFD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-40BI電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HP-900恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；ZHWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；AR224 CN電子天平：奧豪斯國際貿易上海有限公司；KS-600D超聲波清洗器：寧波科勝儀器廠；RⅡ旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；XT-4熔點測定儀：上海華巖儀器設備有限公司；P-2000旋光儀：日本分光株氏會社；FTS-135紅外光譜儀：美國Bio-Rad公司；240PC紫外分光光度儀：日本島津公司；VG AutoSpec-3000質譜儀：英國VG公司；Bruker AV-400核磁共振儀：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株形態鑒定

形態學鑒定：以PDA培養基通過插片培養，對轉化菌株進行形態特征觀察，參考真菌鑒定手冊[16]進行初步鑒定。

1.3.2 菌株分子鑒定

菌株的總DNA的提取用改良十六烷基三甲基溴化銨hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[17]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質量和濃度。PCR反應體系（25μL）：DNATaq酶Mix，10μL；引物ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，2 μL；引物ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2 μL；純凈水，9 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30s；50℃退火30s；72℃延伸1.5min；72℃末端延伸10min；循環30次；4℃保存。

送Invitrogen公司進行測序，用Blast軟件將測得的序列在GenBank數據庫中進行相似性搜索，選用同源性比較高的典型菌株的ITS序列作為參比對象，采用鄰接法用MEGA 7軟件以ITS序列構建鑒定菌株與參比菌株的系統發育樹。

1.3.3 放大發酵培養

取斜面培養基上的菌絲接種入5瓶種子培養基，置于恒溫搖床，溫度30℃，轉速220 r/min，培養5 d。

各配制5 L孕酮和4-AD轉化培養基：每250 mL錐形瓶加入100 mL培養基，經121℃滅菌鍋滅菌冷卻至室溫，將每10 mL種子培養基接種入轉化培養基，置于恒溫搖床，溫度30℃，轉速220 r/min，發酵7 d。

1.3.4 轉化產物的提取

發酵產物經減壓抽濾，菌絲體用乙醇浸泡超聲提取3次，過濾、合并乙醇浸提液，減壓濃縮；濾液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮。合并上述粗提物，得到轉化產物的總提取物。

1.3.5 高效液相色譜分析檢測方法

色譜柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相：甲醇∶水=41∶59（V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：243 nm；柱溫：室溫；進樣量：5 μL。

1.3.6 轉化產物的分離與鑒定

將轉化產物提取物用甲醇溶解，利用硅膠柱層析進行分離，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯體系。轉化孕酮粗提物用200～300目的硅膠拌樣，通風櫥下放置晾干，用200～300目硅膠柱層析，干法上樣，用石油醚和乙酸乙酯的不同體積比進行梯度洗脫，石油醚與乙酸乙酯的體積比分別為：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脫液濃縮真空抽干后用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測分析法分析，相同組分合并。轉化4-AD粗提物用200～300目硅膠柱層析，干法上樣，用石油醚和乙酸乙酯的不同體積比進行梯度洗脫，石油醚與乙酸乙酯的體積比為：10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、0∶1，洗脫液濃縮真空抽干后，用TLC檢測分析法分析，相同組分合并。參考WU Y等[14-15]的方法，將分離得到的化合物以核磁共振、紅外光譜、質譜分析等手段進行結構解析。

2 結果與分析

2.1 轉化菌株的形態學鑒定

以PDA培養基通過插片培養，對轉化菌株進行形態特征觀察，該菌的菌落及菌絲形態見圖1。由菌株YNCA0116在PDA培養基生長5 d，菌落背面褐色、正面中間褐色邊緣白色，菌絲分隔，菌絲生于基質內，PDA培養基未產生孢子，在促孢培養基上也未產生孢子。初步鑒定菌株YNCA0116為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

圖1 菌株YNCA0116菌落及菌絲顯微形態Fig.1 Colony morphology and mycelium micromorphology of strainYNCA0116

2.2 菌株16S r RNA基因序列鑒定及系統發育分析

菌株的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。

圖2 菌株YNCA0116 PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of strain YNCA0116

由圖2可知，菌株YNCA0116 PCR擴增的ITS序列片段長度介于500～750 bp。ITS序列測序后進行建樹分析，結果見圖3。結果表明，菌株YNCA0116與長直孢刺盤孢NR 145380.1ColletotrichumgigasporumCBS133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporum CBS 181.52聚為一小簇，與多株刺盤孢屬菌株聚為一大簇，與長直孢刺盤孢NR 145380.1Colletotrichum gigasporumCBS 133266和KF687734.1Colletotrichum gigasporumCBS181.52相似度為100%，因此確定轉化菌株為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

圖3 菌株YNCA 0116的ITS序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA 0116 based on ITS sequence

2.3 高效液相色譜分析結果

對刺盤孢屬菌株YNCA0116轉化孕酮和4-AD發酵液的粗提物進行高效液相色譜（high performance liquid chromatogram，HPLC）分析，結果分別見圖4和圖5。

圖4 無底物培養基（A）、孕酮標準品（B）及菌株YNCA 0116轉化孕酮發酵液（C）的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of non-substrate medium(A),progesterone standard(B)and progesterone fermentation liquid biotransformed by strain YNCA 0116(C)

圖5 4-AD標準品（A）及菌株YNCA 0116轉化4-AD發酵液（B）的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of 4-AD standard(A)and 4-AD fermentation liquid(B)biotransformed by strain YNCA 0116

由圖4可知，無底物培養基發酵在1.332 min出現培養基發酵的背景峰，孕酮出峰時間為14.014 min，孕酮轉化產物出現在3.685 min（峰Ⅰ）和3.969 min（峰Ⅱ），孕酮幾乎完全轉化。由圖5可知，4-AD出峰時間為28.253min，4-AD主要產轉化物出現在2.658 min（峰Ⅲ），4-AD幾乎完全轉化。

2.4 轉化產物的結構鑒定

孕酮轉化提取物分離純化，得到化合物1和化合物2；4-AD轉化提取物分離純化，得到化合物3。化合物1、2和3經核磁共振、質譜、紅外光譜、紫外光譜分析，結構如圖6。

圖6 菌株YNCA 0116轉化產物結構Fig.6 Structures of the transformation products of strain YNCA 0116

三種化合物的結構解析如下：

化合物1：白色粉末，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+11.30°（CHOH）D3熔程：230～240℃。紫外光譜最大吸收波長243 nm，紅外光譜主要基團頻率為3453cm-1、3132cm-1、2361cm-1、165cm-1、1456cm-1、1128cm-1。核磁共振碳譜化學位移為44.7（t，C-1），40.1（t，C-2），200.5（C=O，C-3），124.5（d，C-4），171.1（s，C-5），35.7（t，C-6），34.8（t，C-7），18.5（d，C-8），60.7（d，C-9），34.3 s，C-10），68.8（d，C-11），50.6（t，C-12），33.7（s，C-13），62.2 d，C-14），72.7（d，C-15），37.6（t，C-16），59.3（d，C-17），15.8 q，C-18），31.5（q，C-19），208.1（C=O，C-20），31.7（q，C-21）；核磁共振氫譜化學位移為5.74（1H，m，H-4），4.05（1H，m，H-11），4.06（1H，m，H-15），0.71（3H，s，H-18），1.16（3H，s，H-19），1.98（3H，s，H-21）。電噴霧質譜顯示準分子離子峰質荷比為369[M+Na]+，分子式：C21H30O4。與文獻[18-19]對照一致，鑒定其結構為：11α,15α-二羥基孕酮（11α,15α-dihydroxyprogesterone）。

化合物2：白色粒狀晶體，無味，易溶氯仿、吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]25=+4.6°DCH3OH），熔程：246～250℃。紫外光譜最大吸收波長243nm，紅外光譜主要基團頻率為3 443 cm-1、3 373 cm-1、1 720 cm-1、1697cm-1、1659cm-1。核磁共振碳譜化學位移為39.4（t，C-1），37.7（t，C-2），200.8（C=O，C-3），127.2（d，C-4），168.0（s，C-5），73.3（d，C-6），44.4（t，C-7），20.3（d，C-8），59.1（d，C-9），28.5 s，C-10），69.0（d，C-11），50.6（t，C-12），39.2（s，C-13），55.5 d，C-14），31.4（t，C-15），23.1（t，C-16），63.3（d，C-17），18.5（q，C-18），24.3（q，C-19），208.5（C=O，C-20），34.5（q，C-21）；核磁共振氫譜化學位移為5.82（1H，m，H-4），4.11（1H，t，J=10.5Hz，H-11），4.35（1H，t，J=3Hz，H-6），0.66（3H，s，H-18），1.51（3H，s，H-19），1.91（3H，s，H-21）。質譜顯示準分子離子峰質荷比為369[M+Na]+，與文獻[20]對照一致，鑒定其結構為：6β,11α-二羥基孕酮（6β,11α-dihydroxyprogesterone）。

化合物3：白色粉末，易溶吡啶，微溶甲醇、乙酸乙酯、氯仿，不溶石油醚和乙醚。比旋光度[α]2D8=+222±1°（CHCl3），熔程：221～222℃。紫外光譜最大吸收波長243 nm，紅外光譜主要基團頻率為3 388 cm-1、2 922 cm-1、1 736 cm-1、1 657 cm-1、1 302 cm-1。核磁共振氫譜化學位移為1.37（3H，s，H-18），1.39（3H，s，H-19），3.23（1H，m，H-15），3.21（1H，m，H-11），5.90（1H，s，H-4）。核磁共振碳譜化學位移為41.0（t，C-1），38.5（t，C-2），199.6（C=O，C-3），124.8（d，C-4），171.7（s，C-5），36.0（t，C-6），35.3（t，C-7），32.9（d，C-8），60.3（d，C-9），34.3（s，C-10），68.4（d，C-11），51.4（t，C-12），44.1（s，C-13），47.8（d，C-14），69.6（d，C-15），57.7（t，C-16），216.0（C=O，C-17），15.5（q，C-18），22.1（q，C-19），質譜顯示準分子離子峰質荷比為339[M+Na]+，與文獻[21]對照一致，鑒定其結構為：11β,15α-二羥基-4-雄烯二酮（11β,15α-dihydroxy-4-androstendione）。

3 結論

能轉化孕酮和4-AD的菌株YNCA0116為刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）。

從菌株YNCA0116轉化孕酮的HPLC分析可以看出，孕酮被大部分轉化為11α,15α-二羥基孕酮，轉化專一性較好，極少部分轉化為6β,11α-二羥基孕酮。在HPLC圖上幾乎看不到底物，表明轉化完全，以后的工作中將嘗試用發酵罐進行轉化研究。為實現更為專一的轉化，需通過轉化過程的優化，減少或消除6β,11α-二羥基孕酮的生成。

從菌株YNCA0116轉化4-AD的HPLC分析可以看出，4-AD被大部分轉化為11β,15α-二羥基-4-雄烯二酮，轉化專一性較好，未分離出其它轉化產物。在HPLC圖上幾乎看不到底物，表明轉化完全，以后的工作中將嘗試用發酵罐進行轉化研究。

刺盤孢屬菌株YNCA0116轉化孕酮和4-AD都得到二羥基產物，引入15α羥基的立體選擇性，但11位羥基化時，孕酮為α構型，4-AD為β構型。本研究尚需以該菌株對更多的甾體化合進行轉化研究，并深入研究轉化機理，以明確該菌株轉化甾體化合物的特點，為甾體藥物的研究和開發提供更多的選擇。

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