浮游球衣菌S9產(chǎn)鐵氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)特性研究

鄭 虹，張曉榕，吳曉梅，鄧加聰*

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300；2.近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福清 350300）

鐵錳氧化鞘細(xì)菌是一類具有氧化鐵、錳能力的革蘭氏陰性菌，是活性污泥中的主要菌群[1]。除了可用于生產(chǎn)生物可降解材料——聚-β-羥丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）外，在貴重金屬和有毒金屬的富集及生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境評(píng)價(jià)[2-6]等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。

鐵氧化酶和錳氧化酶是鐵錳氧化鞘細(xì)菌在污水治理中的重要酶類[7-8]，它們能夠降解污水中的有機(jī)物質(zhì)和一些毒性物質(zhì)；將可溶性的Fe2+、Mn2+氧化成Fe（OH）3和MnO2等不溶態(tài)的鐵錳化合物，之后經(jīng)沉淀過(guò)濾，除去水中的鐵和錳，從而改善水體[9]。該方法簡(jiǎn)便、有效、經(jīng)濟(jì)，且不需投加藥物，避免造成二次污染。

由于鞘細(xì)菌鐵氧化酶產(chǎn)率較低，且活性不穩(wěn)定，對(duì)鐵氧化酶的分離純化具有一定的難度，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)菌株所產(chǎn)鐵氧化酶[10-11]的研究較少，很多學(xué)者主要集中在對(duì)菌株的篩選鑒定[12-13]、菌株在環(huán)境治理方面[3，6，14]的應(yīng)用。汪令翔等[12]從活性污泥中篩選到一株產(chǎn)鐵氧化酶菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、鏡檢、生理生化及16S rDNA基因的遺傳分析，并對(duì)該菌株的最適溫度、pH及金屬離子進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，將該菌株命名為假單胞菌GS8，該菌株的最適溫度和pH范圍分別為30℃和6.5～7.5，K+與Mg2+對(duì)鐵氧化酶活性有一定的激活作用，Pb2+與Ag+對(duì)鐵氧化酶活性有一定的抑制作用，而以Zn2+對(duì)鐵氧化酶的抑制作用表現(xiàn)最強(qiáng)。本研究前期篩選到一株具有鐵氧化酶活性的菌株——浮游球衣菌S9[15]，通過(guò)改良后的鄰菲羅啉法[16-17]對(duì)菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件及酶學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為浮游球衣菌S9鐵氧化酶的生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

浮游球衣菌（Sphaerotilus natans）S9：福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸鎂、磷酸氫二鉀、尿素、葡萄糖、硫酸銨、硝酸鈉、檸檬酸鐵銨、鄰菲羅啉、蛋白胨、酵母膏、甘油（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

CGY培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，甘油10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

尿素培養(yǎng)基：尿素0.5 g/L，葡萄糖 1 g/L，MgSO·47H2O 0.05 g/L，K2HPO40.1 g/L，自然pH。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g/L，NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，CaCl·26H2O 0.1 g/L，檸檬酸鐵銨10 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基在121℃條件下濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40B1型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BS224S電子天平：賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FA2204B型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海湘儀離心機(jī)有限公司；THZ-25大容量恒溫振蕩器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；SPX-15OB-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；WFJ-7200型分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶影響的單因素試驗(yàn)

（1）碳源種類：按3%的接種量將種子液接種于添加不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸鈉）的發(fā)酵培養(yǎng)基，這些碳源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵銨，每種碳源的添加量為1%，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（2）檸檬酸鐵銨添加量：按3%的接種量將種子液接種于添加不同濃度（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%）檸檬酸鐵銨的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（3）氮源種類：按3%的接種量將種子液接種于添加不同氮源（硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、尿素）的發(fā)酵培養(yǎng)基，這些氮源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鈉和硫酸銨，每種氮源的添加量為0.1%，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（4）氯化銨添加量：按3%的接種量將種子液接種于不同氯化銨添加量（0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（5）初始pH：按3%的接種量將種子液接種于不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（6）培養(yǎng)時(shí)間：按3%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，每隔12 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性，取樣時(shí)間為24 h、36 h、48 h、56 h、64 h、72 h、84 h、96 h。

（7）裝液量：按3%的接種量將種子液接種于不同裝液量（25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)84h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

（8）培養(yǎng)溫度：按3%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，不同溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)84 h，測(cè)定發(fā)酵液的鐵氧化酶活性。

1.3.2 對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶影響的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以檸檬酸鐵銨、氯化銨、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量及培養(yǎng)溫度作為考察因素，鐵氧化酶活性作為考察指標(biāo)，選用L18（36）正交表，進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme-producing conditions optimization

1.3.3 鐵氧化酶活性的酶學(xué)特性研究

發(fā)酵液4℃、8 000 r/min離心10 min，除去沉淀，上清液備用。

（1）溫度對(duì)酶活性的影響：取5mL上清液于不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）條件下保溫30 min，測(cè)定樣品的鐵氧化酶酶活。

（2）pH對(duì)酶活性的影響：取5 mL上清液用0.5 mol/L的氫氧化鈉和0.5 mol/L的鹽酸將其pH分別調(diào)至（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），室溫下放置30min，測(cè)定樣品的鐵氧化酶酶活。

（3）金屬離子對(duì)酶活性的影響：5 mL上清液中分別添加不同金屬（MnCl2、NaCl、MgCl2、ZnCl2、KCl、PbNO3、CuCl2、AgNO3），使離子的終濃度達(dá)到5 mmol/L。30 min后測(cè)定樣品的鐵氧化酶酶活。

1.3.4 鐵氧化酶活力的測(cè)定方法[16-17]

鐵氧化酶活力的大小以該酶對(duì)二價(jià)鐵離子的氧化率來(lái)表示，氧化率越高表明酶的活性越高。具體操作方法如下：

將發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心5 min，其上清液為粗酶液。按順序加入以下試液于試管中：1mL質(zhì)量濃度為4.0g/L的FeSO4，1 mL 0.02 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液，8 mL粗酶液。搖勻后放入30℃水浴鍋中保溫30 min。然后將反應(yīng)液移入100 mL容量瓶中，再加10 mL 0.02 mol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液，搖勻后加10 mL 0.1%鄰啡啰啉溶液，靜置10 min后于8 000 r/min、4℃離心 5 min，以水為參比，測(cè)OD510nm值。鐵氧化率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖1 不同的碳源對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on ferroxidase produced by strain S9

由圖1可知，菌株S9可利用一些簡(jiǎn)單的化合物，如醇、糖類物質(zhì)等，不同碳源對(duì)菌株S9鐵氧化酶具有一定的影響，添加有檸檬酸鐵銨＞可溶性淀粉＞甘油＞蔗糖＞檸檬酸鈉＞葡萄糖，當(dāng)檸檬酸鐵銨為碳源時(shí)，該菌株的鐵氧化率可達(dá)53.92%。可能因?yàn)闄幟仕徼F銨中含有一定的鐵離子，對(duì)于鞘細(xì)菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)的作用。因此，選擇檸檬酸鐵銨作為最佳碳源。

2.1.2 檸檬酸鐵銨添加量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

由圖2可知，檸檬酸鐵銨的添加量對(duì)菌株鐵氧化酶的影響較大，菌株鐵氧化酶隨檸檬酸鐵銨添加量的增加呈先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)檸檬酸鐵銨添加量＜1.0%時(shí)，鐵氧化率和相對(duì)酶活隨著檸檬酸鐵銨的增加而增強(qiáng)；當(dāng)檸檬酸鐵銨添加量為1.0%時(shí)，菌株的鐵氧化率和相對(duì)酶活均達(dá)到最大值，分別為58.32%和100%；當(dāng)檸檬酸鐵銨添加量＞1.0%時(shí)，鐵氧化率和相對(duì)酶活隨著檸檬酸鐵銨的增加而減弱。檸檬酸鐵銨作為鞘細(xì)菌的最適碳源，低濃度或高濃度的檸檬酸鐵銨都不利于菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響菌株產(chǎn)鐵氧化酶的活性。因此，最佳檸檬酸鐵銨添加量為1.0%。檸檬酸鐵銨添加量的這個(gè)結(jié)果跟江令翔等[12]的研究結(jié)果一致。

圖2 檸檬酸鐵銨添加量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.2 Effect of ferric ammonium citrate adtion on ferroxidase produced by strain S9

2.1.3 不同氮源對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖3 不同的氮源對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on ferroxidase produced by strain S9

由圖3可知，不同氮源對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響各不相同，氯化銨＞（硫酸銨0.05%+硝酸鈉0.05%）＞硝酸鈉＞硫酸銨＞尿素，當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)，菌株的鐵氧化率最強(qiáng)，其鐵氧化率為65.41%。因此，選擇氯化銨（NH4Cl）作為最適氮源。

2.1.4 氯化銨添加量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖4 氯化銨添加量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.4 Effect of ammonium chloride addition on ferroxidase produced by strain S9

由圖4可知，菌株S9鐵氧化酶先隨著NH4Cl添加量的增加而增加，當(dāng)NH4Cl添加量為0.10%時(shí)，其氧化率和相對(duì)酶活均達(dá)到最大，分別為60.44%和100%；之后發(fā)酵液的鐵氧化率隨著NH4Cl濃度的增加反而減少。低濃度的氯化銨對(duì)菌株鐵氧化酶的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，而高濃度的氯化銨有抑制作用。因此，最佳NH4Cl添加量為0.10%。

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖5 初始pH對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on ferroxidase produced by strain S9

由圖5可知，菌株S9的適宜生長(zhǎng)的pH范圍為6.5～7.5，菌株S9在初始pH值為7.0時(shí)酶活力最高，其鐵氧化率可達(dá)到64.89%，而當(dāng)初始pH＞7.5或初始pH＜6.5時(shí)，其相對(duì)酶活均已下降至80%以下。太高或太低的初始pH不利于菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響到菌株產(chǎn)鐵氧化酶的能力。因此，菌株S9的最適生長(zhǎng)的初始pH值為7.0。

2.1.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，浮游球衣菌的延遲生長(zhǎng)期為1～2 d，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為3～5 d，穩(wěn)定生長(zhǎng)期為5～9 d，衰亡期為10 d之后。由圖6可知，菌株S9的鐵氧化酶隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增后減的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為84 h時(shí)，此時(shí)菌株已進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，菌株的鐵氧化酶活性達(dá)到最高，其氧化率為68.58%。因此，選擇培養(yǎng)84 h為最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.6 Effect of culture time on ferroxidase produced by strain S9

2.1.7 培養(yǎng)基裝液量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖7 不同裝液量對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.7 Effect of liquid volume on ferroxidase produced by strain S9

由圖7可知，菌株S9的鐵氧化率隨著裝液量的增加呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，其鐵氧化率達(dá)到最高，為66.22%。裝液量太低，不能為菌體提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利，進(jìn)而不利于鐵氧化酶的合成和積累；而裝液量太高，發(fā)酵液中的溶氧量太低，不利于菌株的生長(zhǎng)，也會(huì)影響菌株合成和積累鐵氧化酶。因此，最適裝液量為50 mL/250 mL。

2.1.8 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響Fig.8 Effect of culture temperature on ferroxidase produced by strain S9

由圖8可知，不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶有一定的影響，溫度對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的影響呈先增后降的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵液的鐵氧化率達(dá)到最大值，為71.25%，培養(yǎng)溫度＜28℃或培養(yǎng)溫度＞32℃時(shí)，發(fā)酵液中鐵氧化酶的相對(duì)酶活都低于40%。因此選擇30℃為其最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

以檸檬酸鐵銨、氯化銨、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量及培養(yǎng)溫度作為考察因素，以鐵氧化率作為考察指標(biāo)，選用L18（36）正交表，進(jìn)行18個(gè)試驗(yàn)分析這6個(gè)因素對(duì)酶活力的影響。結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme-producing conditions optimization

由表2可知，各因素對(duì)菌株產(chǎn)鐵氧化酶的影響主次順序?yàn)闄幟仕徼F銨添加量＞培養(yǎng)溫度＞初始pH＞培養(yǎng)時(shí)間＞裝液量＞氯化銨添加量，最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的組合為A2B2C2D2E3F2，即檸檬酸鐵銨添加量1.0%，氯化銨添加量0.1%，初始pH值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間84h，瓶裝量75mL/250mL，培養(yǎng)溫度30℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液中鐵氧化率可達(dá)75.25%，與未優(yōu)化前發(fā)酵液中鐵氧化率提高了42.28%。

2.3 鐵氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 不同作用溫度對(duì)酶活性的影響

圖9 不同溫度對(duì)鐵氧化酶活性的影響Fig.9 Effects of different temperatures on ferroxidase activity

由圖9可知，菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶的活性先是隨著作用溫度的升高而升高；當(dāng)作用溫度達(dá)到30℃時(shí)，處理液中鐵氧化酶活性達(dá)到最高，其氧化率為53.62%；之后，鐵氧化酶活性隨著作用溫度的升高反而降低，當(dāng)鐵氧化酶在50℃條件下保溫30 min后，其氧化率已降至15.64%。因此，鐵氧化酶的最適溫度為30℃。

2.3.2 不同pH對(duì)酶活性的影響

圖10 不同pH對(duì)鐵氧化酶活性的影響Fig.10 Effects of different pH on ferroxidase activity

由圖10可知，鐵氧化酶的酶活先是隨pH的升高而升高，之后又隨著pH的升高而降低；酶活的較適pH為7～8，當(dāng)pH 7.5時(shí)，酶的氧化率仍可達(dá)65.26%。因此，鐵氧化酶的最適pH為7.5。

2.3.3 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響

由圖11可知，不同金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)鐵氧化酶的活性影響各不相同，各金屬離子對(duì)鐵氧化酶活性的影響如下：Mg2+＞Na+＞K+＞Cu2+＞Pb2+＞Ag+＞Zn2+＞Mn2+，其中Mg2+、K+、Na+對(duì)酶的活性具有增強(qiáng)作用，而Pb2+、Ag+會(huì)抑制酶的部分活性，Mn2+、Zn2+對(duì)酶具有很強(qiáng)的抑制作用。

圖11 不同金屬離子對(duì)鐵氧化酶活性的影響Fig.11 Effects of different metal ions on ferroxidase activity

3 結(jié)論

浮游球衣菌是一類絲狀細(xì)菌，是活性污泥中凈化水體的主要菌群。培養(yǎng)因素和培養(yǎng)條件對(duì)菌株S9產(chǎn)鐵氧化酶具有較大的影響。本研究對(duì)鞘細(xì)菌S9產(chǎn)鐵氧化酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最適產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸鐵銨1.0%，NH4Cl 0.1%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·6H2O 0.01%；最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)初始pH7.0，培養(yǎng)溫度30℃，裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間84 h。在此優(yōu)化條件下，鞘細(xì)菌S9產(chǎn)生鐵氧化酶的氧化活性高達(dá)75.25%，與未優(yōu)化前發(fā)酵液中鐵氧化率提高了42.28%。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)鐵氧化酶的最適溫度為30℃，最適pH值為7.5，Mg2+、K+、Na+對(duì)酶的活性具有增強(qiáng)作用，而Pb2+、Ag+會(huì)抑制酶的部分活性，Mn2+、Zn2+對(duì)酶具有很強(qiáng)的抑制作用。

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