可高效降解甜高粱秸稈產糖的纖維素酶研究

許富強，王曙陽*，董妙音，姜伯玲，李蕎蕎，陳積紅，3，李文建，3

（1.中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院大學 生命科學學院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室，甘肅 武威 733001）

近年來，隨著化石能源的過度開采和利用，傳統能源日益緊缺并將枯竭，能源問題已成為全社會所面臨的首要難題。到2050年，全球每年的石油供應量將由目前的25億桶降至不足5億桶，嚴重威脅人類社會的生存和發展，因此越來越多的科學家致力于探究新的能量來源以緩解能源危機[1]。全世界每年光合作用產生的植物體干物質達1 500億t，其中作為自然界中十分豐富的資源，纖維素及半纖維素的含量占了50%以上[2]，如常見的作物秸稈、飼草、甘蔗渣中都富含纖維素[3]，若能利用纖維素酶將這些纖維素轉化成可以被直接或間接利用的糖類[4-5]，再借助生物發酵生產乙醇[6-7]等能源物質，將實現對纖維素的有效利用，緩解能源短缺問題[8]。纖維素酶廣泛應用于飼料、食品工業以及紡織業、造紙業和洗滌業領域，技術已經比較成熟[9]，但在燃料酒精生產方面存在諸多挑戰，如高效的酶水解體系的建立[10]、高產纖維素酶菌株的構建及高酶活纖維素酶液的制備[11-12]。

本研究通過測定5組實驗室自制的纖維素酶液的濾紙酶活（filter paper activity，FPA）、其分解微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）后產生的還原糖含量以及對甜高粱秸稈纖維素的轉化率，與商品纖維素酶作比較，從而優選出一種可高效降解甜高粱秸稈的纖維素酶，以期為后續纖維素酶分解甜高粱秸稈產生葡萄糖，進而為發酵生產生物乙醇提供論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱秸稈：以種植于中國科學院近代物理研究所武威現代產業園的甜高粱秸稈為供試材料，待其成熟，用五點取樣法采樣，樣品于105℃烘箱中烘干至恒質量，冷卻至室溫后用粉碎機粉碎，過20目篩備用。

纖維素酶液：實驗所用的纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶Ⅴ均由中國科學院近代物理研究所微生物實驗室用重離子輻照誘變處理過的綠色木霉（Trichoderma viride）和黑曲霉（Aspergillus niger）突變體采取5種不同的發酵工藝進行中試發酵生產，產物先經6層紗布過濾后，于4℃、4000r/min條件下離心10 min，上清液即為纖維素酶液[13]；商品纖維素酶：山東隆科特酶制劑有限公司。

微晶纖維素：香港BBI Life Sciences有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）：上海中秦化學試劑有限公司；十六烷三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）：美國SPECTRUM公司；濃H2SO（4純度為98%）、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：天津北辰方正試劑廠；葡萄糖：天津市大茂化學試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GUJS-10-100AUTOBIO2000機械攪拌發酵罐：鎮江東方生物工程設備技術有限公司；Bioteck酶標儀：時代聯想生物科技有限公司；5417R高速臺式冷凍離心機：德國Kendro公司；Milli-Q Direct8純水/超純水一體化系統：默克化工技術有限公司；06粗纖維測定儀：濟南儀器盛泰有限公司；MB-102振蕩型恒溫金屬浴：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

DNS試劑與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量和光吸收值成比例關系，用酶標儀測出反應后的吸光度值可得還原糖含量[14]。具體操作如下：準確配制1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL的葡萄糖標準液，分別取不同質量濃度的葡萄標準溶液20μL于1.5mL的離心管中，依次加入40μL蒸餾水和140μLDNS試劑，使體系總體積為200μL，在95℃、300 r/min的金屬浴上孵化5 min，立即冷卻后取出40 μL加入到含有160 μL蒸餾水的酶標板中，在波長520 nm處用酶標儀測其值。以吸光度值OD520nm（y）為縱坐標，葡萄糖標準溶液質量濃度（x）為橫縱標，得到葡萄糖標準回歸方程為：y=4.122x-0.378 1，相關系數R2=0.999 5。根據葡萄糖標準曲線回歸方程計算水解體系中還原糖含量。

1.3.2 纖維素酶濾紙酶活的測定

濾紙的聚合度和結晶度相較于其他纖維材料來說處于“中等”程度，實驗中經常以其為原料經纖維素酶水解生成還原糖的量來衡量纖維素酶總的糖化能力，它反映了纖維素酶中內切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶三個酶組分的協同作用能力，統稱濾紙酶活[15-16]。具體操作：在1.5 mL的離心管中加入3 mm×4 mm的濾紙塊，再加入40 μL pH=4.6的檸檬酸鈉緩沖液和20 μL纖維素酶液，在50℃金屬浴上300 r/min孵育60 min后加入140 μL DNS試劑，在95 ℃金屬浴上300 r/min孵化5 min，冷卻后取出40 μL加入含有160 μL蒸餾水的酶標板中，在波長520 nm處用酶標儀測其OD520nm值，然后根據標準曲線回歸線方程計算還原糖含量，根據纖維素酶酶活定義得FPA酶活[17]。

纖維素酶酶活定義：以每毫升酶液在1 min內水解反應體系中底物生成每微克葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.3.3 纖維素酶分解微晶纖維素實驗

微晶纖維素（MCC）在結構上是以β-1,4-葡萄糖苷鍵結合的直鏈形式多糖，它由天然纖維素經水解至極限聚合度得到的，故與纖維素在化學反應特性上具有相類似的特點[18]，因此在一定反應時間內，可以用纖維素酶分解微晶纖維素產生葡萄糖的量來衡量纖維素酶分解纖維素的能力。MCC的分解實驗參照BOMMARIUS A S等[19]研究方法，取100 mg/mL的微晶纖維素溶液5 mL，pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液2 mL，酶液1 mL，在50℃、200 r/min的搖床上反應8 h。反應畢，測定微晶纖維素分解實驗中的還原糖含量。具體操作為：反應液經4 000 r/min離心10 min后，取60 μL上清液，加入140μLDNS溶液，在95℃金屬浴上加熱5min，冷卻至室溫后，取40 μL加入含有160 μL蒸餾水的酶標板中，在波長520 nm處進行酶標儀檢測。

1.3.4 纖維素酶分解甜高粱秸稈的實驗

甜高粱秸稈中纖維素的含量的測定：纖維素的含量通過酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）減去酸性洗滌木質素（acid detergent lignin，ADL）可得[20-23]。

甜高粱秸稈由占80%左右的細胞壁和細胞內容物組成，秸稈的細胞內容物基本上能夠被完全消化，而含有較多纖維素的細胞壁則很難被降解。由于纖維素極難溶于水，因而纖維素酶和纖維素的作用屬于固-液雙相反應。在酶解反應時，作為液相的纖維素酶分子先吸附到固相的纖維素表面上，然后酶和底物形成不穩定的復合物，并在固相表面上進行酶水解反應從而產生還原糖[24]。具體操作：準確稱取1 g過20目篩的甜高粱置于培養皿中，按70%的含水量加蒸餾水0.7 mL，分別按30%的酶量，加入纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶Ⅴ、商品纖維素酶，每組設置3個平行，然后于50℃恒溫培養箱中培養，于0、24 h、48 h、72 h時參考國標GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》[25]用斐林試劑熱滴定法測其還原糖含量[25]。纖維素轉化率的計算公式如下所示：

1.3.5 數據處理

實驗數據用SPSS21.0進行分析，并用Origin8.0進行圖表處理，每組設3個平行，結果用平均值±標準誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶濾紙酶活性的測定結果

5組實驗室自制的纖維素酶和商品纖維素酶的濾紙酶活（FPA）性測定結果如圖1所示。

圖1 纖維素酶的濾紙酶活測定結果Fig.1 Determination results of filter paper activity of cellulase

由圖1可知，5組自制纖維素酶的FPA極顯著低于商品纖維素酶的FPA（P＜0.01）。纖維素酶Ⅱ的FPA明顯高于其他4組自制的纖維素酶（P＜0.05），分別是纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶ⅤFPA的8.05、11.57、2.96、2.63倍。其次，纖維素酶Ⅴ顯著高于纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ（P＜0.05），略高于纖維素酶Ⅳ，但不顯著（P＞0.05）。

2.2 纖維素酶對微晶纖維素分解效果

考察5組實驗室自制的纖維素酶和商品纖維素酶對微晶纖維素（MCC）的分解效果，結果如圖2所示。

圖2 纖維素酶的微晶纖維素的分解結果Fig.2 Decomposition results of microcrystalline cellulose withcellulase

由圖2可知，商品纖維素酶對MCC的分解能力最強，極顯著強于其他自制的纖維素酶（P＜0.01），纖維素酶Ⅴ次之，顯著強于纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ（P＜0.05），且比纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅳ分解MCC的能力略強，但未達到差異顯著性水平（P＞0.05）。纖維素酶Ⅴ分解MCC的能力分別比纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ的分解MCC能力強14.31倍、0.94倍、6.35倍、1.43倍。這可能是由于不同的纖維素酶液中內切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的比例不同，導致其在分解不同結晶度和聚合度的纖維素時存在差異。

2.3 纖維素酶對甜高粱秸稈纖維素的分解效果

酸性洗滌纖維（ADF）包括幾乎全部的纖維素、木質素以及少量的酸不溶灰分，酸性洗滌木質素（ADL）常用72%的濃硫酸水解ADF后所得的不容物測得，主要由木質素和酸不溶灰分組成，實驗中用ADF含量減去ADL含量表示秸稈中的纖維素的含量，甜高粱秸稈中ADF與ADL含量測定結果如表1所示。

表1 甜高粱秸稈中酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質素含量的測定結果Table 1 Determination results of ADF and ADL contents in sweet sorghum straw

由表1可知，甜高粱秸稈的酸性洗滌纖維（ADF）含量為44.58g/100 g，酸性洗滌木質素（ADL）含量為6.43 g/100 g，通過本實驗中ADF含量減去ADL含量可測得文中所用的實驗材料甜高粱秸稈的初始纖維素含量為38.16 g/100 g。

用斐林熱滴定法測定0、24 h、48 h、72 h時反應體系中還原糖含量，根據公式（1）得到纖維素酶對甜高粱秸稈纖維素的轉化率，結果如圖3所示。

圖3 纖維素酶降解甜高粱秸稈的纖維素轉化率Fig.3 Cellulose conversion ratio of sweet sorghum straw with cellulase

由圖3可知，加入纖維素酶后，隨著反應時間的延長甜高粱秸稈轉化率呈現升高趨勢，表明5組自制的纖維素酶和商品纖維素酶均能將甜高粱秸稈中的纖維素分解生成還原糖。在0～72h的反應時間內，商品纖維素酶對甜高粱秸稈中纖維素的轉化率一直高于5組自制的纖維素酶，在48h時，商品纖維素酶對甜高粱秸稈中纖維素的轉化率達到13.52%，之后基本維持不變（P＞0.05）。除了纖維素酶Ⅰ在24 h時轉化率已達到最高外，其余5組纖維素酶均在48 h之后基本不再降解轉化生成葡萄糖，可能的原因有兩點：一是由于反應時間過長，纖維素酶失活導致酶的活性降低[26]；二是產物葡萄糖抑制了纖維素酶的活性[27]。在自制的5組纖維素酶中，0～48 h內纖維素酶Ⅴ對甜高粱秸稈中纖維素的降解能力最強，在48 h時秸稈中纖維素的轉化率達到了最高，為11.69%，48h以后轉化率基本不變（P＞0.05）。由此可知纖維素酶Ⅴ對甜高粱秸稈纖維素具有較高的親和力，能高效降解甜高粱秸稈中的纖維素，這在后續的實驗研究意義重大。

目前報道的纖維素酶對天然纖維素的降解轉化率最高水平是20%[28]，而本實驗室自制的纖維素酶Ⅴ對甜高粱秸稈纖維素表現出了比較強的降解能力，可見纖維素酶Ⅴ中內切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶組分比例平衡，特別是纖維素酶Ⅴ在高效分解甜高粱秸稈纖維素產糖方面表現的巨大潛力，可作為生物質能源催化生產的商業纖維素酶進一步推廣生產。

3 結論

本研究通過測定重離子誘變技術選育的綠色木霉和黑曲霉所發酵生產的5組自制纖維素酶液和商品纖維素酶的濾紙酶活（FPA），及其對微晶纖維素（MCC）和甜高粱秸稈纖維素的降解效果評價。研究發現，在5組自制的纖維素酶液中，濾紙酶活（FPA）最高的是纖維素酶Ⅱ（1364.84U/mL），可制備高濾紙酶活的商品纖維素酶制劑；纖維素酶Ⅴ的濾紙酶活次之（519.83 U/mL），但其對微晶纖維素和甜高粱秸稈的降解效果均強于纖維素酶Ⅱ，尤其是纖維素酶Ⅴ在50℃、48h時對甜高粱秸稈中纖維素降解能力較強，纖維素轉化率達到了11.69%，這對以甜高粱秸稈為底物酶解產生可發酵的糖進而生產生物乙醇以及高附加值的化工產品意義重大。

[1]CAMBELL C,LAHERRèRE J.The end of cheap oil:Global production of conventional oil will begin to decline sooner than most people think,probably within 10 years[J].Sci Am,1998,3:78-83.

[2]THRAN D,SEIDENBERGER T.Global biomass potentials-resources,drivers and scenario results[J].Energ Sust Dev,2010(10):200-205.

[3]DEUTSCHMANN R,DEKKER R F.From plant biomass to bio-based chemicals:latest developments in xylan research[J].Biotechnol Adv,2012,30(6):1627-1640.

[4]SINNOTT M L.Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer[J].Chem Rev,1990,90(7):1171-1202.

[5]JUTURU V,WU J C.Microbial cellulases:Engineering,production and applications[J].Renew Sust Ener Rev,2014,33(5):188-203.

[6]KUMAR R,SINGH S,SINGH O V.Bioconversion of lignocellulosic biomass:biochemical and molecular perspectives[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35(5):377-391.

[7]彭良才.論中國生物能源發展的根本出路[J].華中農業大學學報，2011，92（2）：1-6.

[8]BHAT M K.Cellulases and related enzymes in biotechnology[J].Biotechnol Adv,2000,18(5):355-383

[9]GUPTA R,MEHTA G,DESWAL D,et al.Cellulases and their biotechnological applications[J].Biotechnol Environ Manage Res Recov,2013,12:89-106.

[10]BANSAL P,HALL M,REALFF M J,et al.Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates[J].Biotechnol Adv,2009,27(6):833-848.

[11]KUHAD C,GUPTA R,SINGH A.Microbial cellulases and their industrial applications[J].Enzyme Res,2011(2):1-9.

[12]姜伯玲.重離子輻照誘變選育纖維素酶高產菌株及其發酵工藝研究[D].北京：中國科學院大學，2016.

[13]姜伯玲，王曙陽，李文建，等.綠色木霉與黑曲霉混合發酵產纖維素酶的研究[J].中國釀造，2015，34（7）：28-31.

[14]ZHAO K,XUE P J,GU G Y.Study on determination of reducing sugar content using 3,5-dinitrosalicylic acid method[J].Food Sci,2008,29(8):534-536.

[15]王義甫，何艷玲，孔令娜.飼用纖維素酶測定方法的探討[J].飼料與畜牧，2008，67（1）：35-38.

[16]張全國，張志萍，趙民善，等.秸稈制氫過程中纖維素酶酶活測定方法研究[J].熱科學與技術，2011，10（1）：128-132.

[17]DECKERSR,ADNEYW S,JENNINGS E,et al.Automated filter paper assayfor determination of cellulose activity[J].Biotechnol Fuels Chem,2003,107(1):687-703.

[18]陸紅佳，鄭龍輝，劉 雄.微晶纖維素在食品工業中的應用研究進展[J].食品與發酵工業，2011，37（3）：141-144.

[19]BOMMARIUS A S,KATONA A,CHEBEN S E,et al.Cellulase kinetics as a function of cellulose pretreatment[J].Metab Eng,2008,10(6):370-381.

[20]楊 勝.飼料分析及飼料質量檢測技術[M].北京：中國農業大學出版社，1999：16-17.

[21]全國飼料工業標準化技術委員會.NY/T 1459—2007飼料中酸性洗滌纖維的測定[S].西安：農業部飼料質量監督檢查測試中心，2007.

[22]全國飼料工業標準化技術委員會.GB/T 20805—2006飼料中酸性洗滌木質素（ADL）的測定[S].北京：中國標準出版社，2006.

[23]許富強，董妙音，王曙陽，等.甜高粱最佳青貯時期及延期對其營養成分的影響研究[J].飼料研究，2017（4）：20-24.

[24]麻星星.天然纖維素酶法水解條件的研究[D].北京：北京化工大學，2010.

[25]中華人民共和國衛生部、中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.7—2008食品中還原糖的測定[S].北京：中國標準出版社，2008.

[26]WILSON D B,IRWIN D C.Genetics and properties of cellulases[M].New York:Springer Nature,1999,1-21.

[27]YE S,CHENG J.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production:A review[J].Bioresource Technol,2003,34(1):1-11.

[28]MOOD S H,GOLFESHAN A H,TABATABAEI M,et al.Lignocellulosic biomass to bioethanol,a comprehensive review with a focus on pretreatment[J].Renew Sust Energ Rev,2013,27:77-93.