采用不同裝置培養螺旋藻的對比研究

譙順彬，董汝晶，張義明*，田 輝

（貴州工業職業技術學院，貴州 貴陽 550008）

螺旋藻（Spirulina）是一類廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區淡水或鹽堿性湖泊中的原核微生物，因細胞形態為單細胞或多細胞構成的螺旋形絲狀體而得名，屬于藍藻門、藍藻綱、段殖藻目、顫藻科、螺旋藻屬。螺旋藻又稱節旋藻、藍細菌[1]。目前國內外研究較多的為鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）和極大螺旋藻（Spirulina maxima）兩種。螺旋藻干粉中蛋白質含量達60%～70%，遠高于目前動植物食用蛋白含量。細胞中還含有豐富的碳水化合物、藻多糖、不飽和脂肪酸、微量元素及維生素等豐富的營養物質[2]，已被聯合國糧農組織推薦為健康食品之一。

目前，螺旋藻規模化生產仍以光合自養為主，由于藻體生長對地域和環境依賴性強，培養產率低，占地面積大，極大地阻礙了其產業的進一步發展。因此近年來國內外研究人員圍繞螺旋藻培養方式、培養裝置以及功能應用等方面開展了大量研究，使得藻體培養產率、產品品質和應用都得到了提高。在培養方式方面，主要是在光合自養基礎上進行混合營養研究。混合營養即通過向培養基中添加適當的有機營養物來改善細胞代謝過程，降低細胞生長對環境的依賴，促進細胞生長，提高產率和品質[3-4]。在培養裝置方面，主要是進行類型各異的光生物反應器的研究設計[5-8]。光生物反應器是根據光合生物或具有光和能力的組織而設計的一類裝置，除具有普通生物反應器的基本特點外，還需要配置合理的光照系統。在功能開發方面，主要是細胞中藻藍蛋白、藻多糖、β-胡蘿卜素、γ-亞麻酸及微量元素等具有較好的保健功效和藥理作用，在調節血糖、血脂，增強免疫力，抗輻射、抗衰老、抗疲勞以及防癌抑癌等方面具有重要的價值[9-13]。

本試驗采用搖瓶、全自動發酵罐和實驗室自制的垂直板式光生物反應器進行螺旋藻培養研究，并對培養結果進行比較，以提高螺旋藻培養產率為目的，為研制一套經濟高效、結構簡單、便于操作的光生物反應器提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻（fachb-350）：中科院武漢水生生物研究所；

基礎培養基采用AB培養基：碳酸氫鈉13.61 g/L、碳酸鈉4.03 g/L、磷酸氫二鉀0.50 g/L、硝酸鈉2.50 g/L、硫酸鉀1.00 g/L、氯化鈉1.00 g/L、硫酸鎂0.20 g/L、氯化鈣0.04 g/L、維生素B120.15 μg/L、PIV金屬溶液5.00 mL、A5微量元素溶液1.00 mL、蒸餾水993 mL。

葡萄糖、硝酸銨、維生素B1、維生素B12、精氨酸、萘乙酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、丙酮、酒精等試劑（均為AR級）：國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

ZWYR-240恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；BiostatC全自動發酵罐：德國B.BraunBiotechInternational公司；光生物反應器：由課題組設計，采用垂直板式結構，其長×寬×高分別為320mm×80mm×390mm，容積約10.0L。

1.3 試驗方法

1.3.1 接種量試驗研究

采用搖瓶培養：新鮮藻泥經多層無菌紗布過濾后，并用無菌水反復沖洗，按照0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.14 g/L、0.16 g/L、0.18 g/L、0.2 g/L不同質量濃度分別接種到裝有150 mL新鮮培養基的250 mL搖瓶中，溫度控制（30±1）℃，轉速120 r/min，光照強度3.5～4.0 klx，培養7 d后分別測定各接種濃度的平均比生長速率（μ），每個濃度做3個平行取平均值。

1.3.2 光合自養條件下試驗研究

確定接種量后，在光合自養條件下，分別利用上述3種培養裝置進行螺旋藻培養，對比不同裝置中藻體細胞的生長情況。

搖瓶試驗：AB培養基滅菌冷卻后接入150 mL至無菌搖瓶中，搖床培養。轉速調節為120 r/min，光照強度為（4.0±0.3）klx，溫度維持在（30±1）℃、初始pH 9.50±0.01，連續光照條件下培養12 d。

全自動發酵罐試驗：AB培養基滅菌冷卻后裝罐，裝液系數0.8，反應器外壁處光照強度為（4.0±0.3）k1x，通氣攪拌轉速為120 r/min，連續光照培養12 d。

光生物反應器試驗：滅菌后的AB培養基接入光生物反應器中，裝液系數0.8，反應器外壁處光照強度為（4.0±0.5）k1x，溫度維持在（30±1）℃，初始pH9.50±0.01，控制通氣量為210 L/h，連續光照下培養12 d。培養過程中每天定時測定藻體生物量和培養液pH，并定時補加相同溫度的無菌水保持裝液系數恒定。

1.3.3 混合營養條件下試驗研究

根據前期試驗結果[14]，混合營養條件下試驗采用優化培養基。即將AB培養基中碳酸氫鈉、硝酸鈉兩組分分別調整為10、3.5g/L，并依次加入葡萄糖1.242 g/L、硝酸銨0.248 g/L及維生素B10.264 mg/L，其余組分和條件與光合自養培養時相同。

1.3.4 測定方法

藻體生物量的測定：采用干質量法[15]。

藻體生物量以藻體干質量（dry mass，DM）計算。接種后取培養液20 mL于已烘干至質量恒定（干燥溫度85℃）的紙片抽濾，無菌水沖洗兩次，同溫度下再次烘干至質量恒定，用精密電子天平稱量，按下式計算干質量（DM）。

式中：M1為抽濾前紙片烘干質量，g；M2為抽濾后紙片烘干質量，g。

培養過程中，按上述步驟每間隔24 h取樣抽濾，計算最終藻體生物量。

pH測定：用pH-3C數字式酸度計測定培養液的pH；光照強度測定：用LX-101數字光度表來測定光照強度；藻體細胞形態檢測：用ECLIPSE-E200顯微鏡觀察細胞形態和可能的染菌情況，并采用平板涂布的方法進行進一步的檢查。

2 結果與分析

2.1 接種量對藻體細胞比生長速率的影響

接種量對藻體細胞比生長速率影響的變化趨勢見圖1。由圖1可知，接種量對細胞生長繁殖影響較大，其比生長速率呈現先升后降的變化趨勢，當接種量＜0.1 g/L時，比生長速率呈上升趨勢，而＞0.1 g/L時逐漸下降，接種量0.1 g/L時可獲得最大比生長速率0.142 h-1。因此，在接下來的試驗中均采用0.1 g/L的新鮮藻泥進行接種培養。

圖1 接種量對細胞比生長速率的影響Fig.1 Effect of inoculum on the specific growth rate of S.platensiscell

2.2 光合自養培養螺旋藻對比試驗

光合自養條件下藻體細胞在3種裝置中的生長趨勢見圖2。由圖2可知，在光合自養條件下，3種裝置均能滿足藻體細胞的生長需求。藻體細胞在搖瓶和全自動發酵罐中生長緩慢，搖瓶培養至第10天時細胞生物量最大值為0.715 g/L，而全自動發酵罐培養至第12天時為0.789 g/L。相比較于前兩種培養裝置，藻體細胞在光生物反應器中生長速率更快，培養至第9天時細胞生物量最大值為1.277 g/L，比搖瓶培養最大值提高78.6%，比全自動發酵罐培養結果提高61.8%，且培養時間可縮短1～3 d。

主要原因是光合自養條件下光照強度是細胞生長的主要限制性因素，自制光生物反應器采用垂直板式設計，材質為4.0 mm白色玻璃，比表面積為17.98，兩邊各安裝數根12 W白光源日光燈，與反應器外壁燈距約5 cm。在通氣情況下，藻體細胞受光照均勻，細胞生長情況較好，最終培養產率較高。而搖瓶培養時采用水平振動，搖床頂蓋安裝光源，光距較長且細胞光照不均，細胞生長較緩慢，產率最低。采用全自動發酵罐培養時，由于罐體直徑比搖瓶和板式光生物反應器大，細胞間存在屏蔽效應，且藻體細胞受光照時間和通氣攪拌轉速影響，攪拌過慢細胞機械損傷小，光照時間短細胞生長較慢，攪拌過快則葉輪對細胞剪切力增加，導致細胞破壞嚴重，故在發酵罐中培養時只能選擇適合的攪拌轉速。

圖2 光合自養條件下藻體在3種裝置中的生長曲線Fig.2 Growth curves ofS.platensisunder the condition of photoautotrophy in the three devices

2.3 混合營養培養螺旋藻對比試驗

螺旋藻在混合營養條件下采用3種培養裝置進行培養的生長情況見圖3。由圖3可知，與光合自養相比，混合營養條件下3種培養裝置中藻體細胞生長速率均有大幅提升，且3種裝置中細胞生長趨勢與光合自養條件下情況相似。光生物反應器培養9 d后藻體生物量最大值為1.715 g/L，搖瓶培養至10 d后藻體生物量為1.613 g/L，而全自動發酵罐培養12 d后藻體生物量為1.616 g/L，光生物反應器中細胞生物量分別比搖瓶和全自動發酵罐培養時提高6.3%和6.1%。同時，3種裝置中藻體生物量最大值分別比光合自養條件下提高125.6%、104.8%、34.3%。

在混合營養條件下，由于添加了葡萄糖和其他有機營養成分，不僅為細胞生長提供了一定的能源，而且對細胞生長有調節功能，有利于降低細胞生長對光照的依賴。在培養前期藻體細胞主要進行異養生長，待添加的葡萄糖消耗殆盡時，細胞才逐步開始轉為光合自養生長。

圖3 混合營養條件下藻體在3種裝置中的生長曲線Fig.3 Growth curves ofS.platensisunder the conditions of mixotrophy in the three devices

2.4 細胞形態及染菌情況觀察

在光合自養和混合營養兩種條件下，分別對細胞形態及染菌情況進行觀察，結果見圖4。

圖4 在光合自養和混合營養兩種培養條件下藻體細胞形態Fig.4 Cell morphology ofS.platensisunder the conditions of photoautotrophy and mixotrophy

由圖4可知，無論是光合自養還是混合營養，由于藻體細胞一直處于較高的pH范圍（9.50～11.50），多數雜菌仍然難以生長，盡管光生物反應器采用開放式培養，仍未檢測到細胞染菌情況，說明后期試驗可以繼續采用開放式培養。在光合自養條件下，細胞生長速率低，衰亡細胞少，細胞中色素以葉綠素為主，培養液顏色呈深綠色。在混合營養條件下，細胞轉為異養為主，細胞生長速率加快，衰亡細胞較多，光合作用降低，細胞中葉黃素含量增加，導致細胞顏色呈黃綠色，且在反應器底部有少量衰亡細胞聚集。此外，與全自動發酵罐相比，搖瓶和光生物反應器中藻體細胞均未受到機械攪拌損傷，藻體細胞更長，形態更完整，而全自動發酵罐中細胞斷裂明顯。

2.5 光合自養培養藻液pH變化趨勢

在光合自養條件下，培養基中的碳酸根離子與碳酸氫根離子是一組緩沖體系，兩者含量變化導致pH改變是一個動態過程，隨著培養基中無機碳源不斷消耗導致培養液pH不斷上升。因此，培養液pH的變化趨勢在一定程度上可反映培養基中無機碳源消耗的情況。光合自養條件下3種培養裝置中培養液pH的變化趨勢見圖5。由圖5可知，搖瓶和全自動發酵罐中培養液pH上升趨勢基本一致，培養12 d后pH均超過11.0，而光生物反應器中培養液pH最終為10.27，明顯低于前兩種裝置，尤其是培養5 d后pH上升較慢，其原因是光生物反應器為開放式培養，培養過程中除部分水分蒸發外，當空氣泡上升到液面爆裂時，培養液中少量無機鹽會濺到反應器內壁，導致培養基無機成分濃度降低，而每天補加的無菌水進一步增加了培養液稀釋作用，故光生物反應器中培養液pH較低，且后期變化平緩。

圖5 光合自養條件下螺旋藻培養液pH變化情況Fig.5 Change of pH value ofS.platensisculture solution under the condition of photoautotrophy in the three devices

3 結論

本試驗采用搖瓶、全自動發酵罐和自制光生物反應器，3種不同裝置進行螺旋藻培養研究。研究結果表明，采用質量濃度為0.1 g/L的新鮮藻泥接種時可獲得最大生長速率。在光合自養條件下，搖瓶、全自動發酵罐和光生物反應器3種裝置中藻體生物量最大值分別為0.715 g/L、0.789 g/L、1.277 g/L，光生物反應器培養產率比搖瓶培養提高78.6%，比全自動發酵罐培養結果提高61.8%，且培養時間縮短1～3 d。采用混合營養培養時，上述3種裝置獲得的藻體生物量最大值依次為1.613 g/L、1.616 g/L、1.715 g/L，分別比光合自養條件下藻體生物量提高125.6%、104.8%、34.3%。兩種條件下自制的光生物反應器均獲得了最大的培養產率，盡管混合營養培養的藻體細胞品質比光合自養條件下略差，但未發現染菌跡象，且培養產率得到了較大提高，說明自制的光生物反應器具有一定的實用性，為其他研究者從事螺旋藻混合營養研究提供了一定的依據。

但在培養過程中，由于光生物反應器為開放式培養，飛濺到反應器器壁的營養物質有導致染菌的風險，且每天補加無菌水會造成短時內培養基中各成分濃度下降，影響細胞生長。因此，在今后的研究中，本課題組一方面將繼續使用該反應器進行混合營養培養基成分優化及培養方式的研究，另一方面對培養液中無機鹽的消耗速率進行定時檢測，研究無機鹽的補加方式，以期能開發出一套經濟高效、操作簡便、環境友好的螺旋藻培養工藝。

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