乙酰輔酶A含量對釀酒酵母乙酸乙酯合成的影響

鄭 楠，郭慶煥，何亞輝，錢 泓，趙 東，陳葉福*，郭學武，肖冬光

（1.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓 644000）

白酒是世界六大著名蒸餾酒之一，歷史可追溯至數千年。白酒中的微量風味物質是影響白酒品質的主要因素，約占1%～2%，其中酯類物質又占微量成分的60%～90%，因此提高白酒的酯含量對于形成白酒風味典型性具有非常重要的意義[1-2]。乙酸乙酯是清香型白酒的主體香味成分，適量的乙酸乙酯能夠使得酒體豐滿、柔和、香味協調，其含量的高低直接決定清香型白酒品質的好壞。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）是白酒釀造過程中重要的發酵微生物，但產乙酸乙酯較少，清香型白酒中生成乙酸乙酯的主要微生物是產酯酵母，但產酯酵母產酒精能力弱，增加糧耗，且大多數為好氧微生物，液態發酵會阻止產酯作用的進行，因此通過改造釀酒酵母提高乙酸乙酯產量具有重要意義。研究表明[3]，酵母合成乙酸酯類有兩種途徑，一種是在酵母自身所含有的少量酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯；另一種是乙醇和?；o酶A在醇?；D移酶的作用下在釀酒酵母細胞內生物催化生成相應的酯類，這是釀酒酵母中乙酸酯類的主要合成途徑。對于液體發酵，乙酸乙酯的形成依賴于底物乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）、乙醇的濃度和醇乙?；D移酶的活性。

乙酰輔酶A是工業生產上合成膽固醇、酮體和脂質等許多重要產品的前體物。在釀酒酵母中，不同的細胞區隔，如線粒體、胞液和過氧化物酶體中均能產生乙酰輔酶A。在胞液中，丙酮酸經過丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶、乙酰輔酶A合成酶的催化作用形成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A合成酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACS）基因由ACS1和ACS2兩個基因編碼[4]。乙酰輔酶A水解酶（acetyl coenzyme Ahydrolase，ACH）由ACH1基因編碼，催化乙酰輔酶A水解為乙酸和輔酶A，可參與細胞內乙酰輔酶A調節[5]。

目前國內外學者提高乙酸乙酯的含量主要是通過篩選高產乙酸乙酯菌株[6]或者利用基因工程手段過表達醇酰基轉移酶（alcohol acyltransferase，ATF）基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1[7-11]。DONG J等[12]通過調節ATF1基因的啟動子強度使白酒中乙酸乙酯的含量提高了3.1倍。ZHANG C Y等[13]在工業啤酒酵母中通過轉化多拷貝質粒過表達ATF1基因，使乙酸乙酯的產量增加為原來的9倍。提高醇酰基轉移酶能夠在一定程度上提高乙酸乙酯的生成量，但其限制因素還包括底物乙酰輔酶A和乙醇的濃度，釀酒酵母進行酒精發酵會產生充足的乙醇，所以乙酰輔酶A的含量是最根本的限制因素。綜上，通過提高底物乙酰輔酶A的含量來提高乙酸乙酯生成量是一個可行的思路。同時，也為其他以乙酰輔酶A為底物的產品生產奠定了基礎。因此，本研究通過敲除ACH1基因降低乙酰輔酶A的分解，過表達ACS1和ACS2基因增強乙酰輔酶A合成酶的活性，過表達ATF1基因提高底物乙酰輔酶A含量，進而提高乙酸乙酯的生成量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的單倍體菌株α5：天津科技大學天津市工業微生物重點實驗室保藏；游離表達質粒Yep352、過表達ATF1基因的質粒PABBK和帶有釀酒酵母磷酸甘油激酶基因（PGK1）強啟動子的質粒Yep-PGK1、pGAPza質粒：本實驗室保藏；質粒pUG6：德國Hegemann教授惠贈。ACS1/ACS2基因來自于釀酒酵母α5。

1.1.2 培養基及培養條件

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

LB培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

以上兩種培養基，自然pH值，固體培養基加2%瓊脂，121℃滅菌15 min。

半乳糖誘導液態培養基：半乳糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃滅菌15min。

一級種子培養基：糖度為8°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

二級種子培養基：糖度為12°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

發酵培養基：60 g玉米粉按1∶3（g∶mL）的料液比加水，70℃糊化20 min，加30 μL淀粉酶85～90℃液化90 min，加適量營養鹽和酸性蛋白酶及90 μL糖化酶55～60℃糖化20 min后制得。

1.1.3 試劑和酶

淀粉酶（29萬U/mL）、糖化酶（10萬U/mL）：諾維信生物技術有限公司；酸性蛋白酶（10萬U/mL）：尤特爾生化有限公司；蘋果酸脫氫酶（1200U/mg）、檸檬酸合酶（1000U/mg）、限制性內切酶（10 U/μL）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶（350 U/μL）、博來霉素（Zeocin）、遺傳霉素（G418）、Rever TraAceRqPCR RT Kit：寶生物工程（大連）有限公司；卡那霉素抗性基因（KanMX）：德國Merck公司；酵母基因組DNA提取試劑盒、酵母核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；引物：金唯智生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCT-200型聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增儀、DYY-4c型電泳儀：美國BIO-RAD公司；Reference-2型移液槍：法國吉爾森公司；7890型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1260型號高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；StepOnePlusTM實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 突變菌株的構建

（1）引物設計

根據GenBank中ACH1、ACS1、ACS2和ATF1基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件設計PCR反應引物見表1。所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成，酶切位點以下劃線表示。

表1 試驗所用PCR引物Table 1 PCR primers used in the study

續表

（2）重組質粒Yep-PAK1、Yep-PAK2和Yep-ATF1的構建

根據美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）公布的S.cerevisiaeS288c的ACS1和ACS2基因序列，以釀酒酵母α5的基因組為模板，用引物ACS1-U/ACS1-D、ACS2-U/ACS2-D分別PCR擴增ACS1和ACS2基因片段，使用XhoI對質粒Yep-PGK1、ACS1及ACS2基因片段進行酶切、連接，構建重組質粒Yep-PA1和Yep-PA2。用引物K-U/K-D擴增質粒pUG6中的KanMX基因片段，再使用SphI對KanMX基因片段和質粒Yep-PA1、Yep-PA2進行酶切、連接，構建重組質粒Yep-PAK1和Yep-PAK2，構建流程如圖1（a）所示。

以本實驗室構建好的質粒PABBK為模板，PGK1-U和KAN-D為引物，PCR擴增得到4 877 bp的PGK1P-ATF1-PGK1T-KanMX基因條帶，用SmaI酶切Yep352質粒和PGK1PATF1-PGK1T-KanMX基因連接，得到重組質粒Yep-ATF1，構建流程如圖1（b）所示。

圖1 重組質粒Yep-PAK和Yep-ATF1的構建Fig.1 Construction of recombined plasmids Yep-PAK and Yep-ATF1

（3）ACH1基因缺失突變株α5ΔACH1的構建

利用長引物法構建ACH1基因缺失突變株，在ACH1的5′和3′端分別取64 bp和63 bp的同源序列AA和AB，添加到擴增篩選標記KanMX片段的上下游引物K-U和K-D的5′端，構成長引物AK-U和BK-D，從pUG6質粒中擴增具有同源序列的AA-KanMX-AB片段。經醋酸鋰化學轉化法導入到酵母單倍體菌株α5中，轉化后的細胞涂布于含有1000μg/mL G418的YEPD平板上進行篩選，PCR驗證。

（4）過表達ACS基因突變株α5-A的構建

為分別實現ACS1及ACS2基因的整合過表達，以基因ACH1作為替代位點，實現ACS1及ACS2基因過表達的同時ACH1基因的敲除。分別以重組質粒Yep-PAK1和Yep-PAK2為模板，利用長引物AP-U和BK-D，分別PCR擴增得到重組片段AA-PGK1P-ACS1-PGK1T-KanMX-AB及AA-PGK1P-ACS2-PGK1T-KanMX-AB。經醋酸鋰化學轉化法導入到酵母單倍體菌株α5中，使AA和AB兩個片段與酵母基因組上ACH1基因兩側的同源序列發生同源重組，如圖2所示。轉化后的細胞涂布于含有1 000 μg/mL G418的YEPD平板上進行篩選，挑取轉化子并提取酵母基因組，以引物A-U和A′-D，B-U和B-D進行定點上下游定點驗證。得到過表達ACS基因突變株α5-A1和α5-A2。

圖2 重組片段的同源重組過程Fig.2 Process of homologous recombination of recombination fragment

（5）過表達ATF1基因突變株的構建

為了在α5△ACH1、α5-A1和α5-A2這3個菌株中過表達ATF1基因，需要再次利用KanMX抗性基因作為遺傳標記，并且利用G418篩選轉化子，所以需將3個突變株中KanMX基因敲除。Cre/loxP報告基因挽救系統能夠實現上述剔除重組菌株標記基因KanMX的目的。因為本研究所采用的KanMX表達盒兩端帶有兩個同向的重復序列loxP，利用pGAPza質粒上Cre重組酶基因可以識別兩個loxP位點，切除中間的連接部分，再把兩個loxP位點的剩余部分連接在一起，從而實現KanMX篩選標記的敲除。

篩選標記的去除：將pGAPza質粒用醋酸鋰化學轉化到含有KanMX抗性基因的釀酒酵母菌株中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培養36 h。挑取長勢較好的菌落接入到半乳糖誘導液態培養基中培養4～5 h，稀釋涂布在YEPD平板上。挑出單菌落點接于YEPD上，再影印到含有G418抗性的YEPD平板上。在YEPD上生長而在含有G418的平板上不生長的菌株即為KanMX抗性基因敲除的菌株。提取酵母基因組，并通過PCR驗證KanMX抗性基因是否敲除。

過表達ATF1基因突變株的構建：去除重組菌α5ΔACH1，α5-A1和α5-A2中的KanMX篩選標記，得到重組菌α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K。將構建好的Yep-ATF1質粒用醋酸鋰轉化法導入α5中，α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K中，挑取轉化子驗證，得到重組菌株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1。

1.3.2 實時熒光定量PCR

基因ACS1和ACS2的表達水平采用實時熒光定量定量聚合酶鏈反應（RT-FQ-PCR）測定。重組菌株α5-A1和α5-A2 30℃液體培養12 h。用酵母RNA試劑盒提取信使RNA（mRNA），以mRNA為模板，采用反轉錄試劑盒合成互補脫氧核糖核酸（complementaryDNA，cDNA），以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR反應條件：95℃，5s；60℃，30s；72℃，45s；40個循環。以肌動蛋白基因（ACT1）為內參基因，合成引物ACS1-F/ACS1-R、ACS2-F/ACS2-R和ACT1-F/ACT1-R（見表1）。

1.3.3 生長曲線的測定

本實驗采用比濁法測定菌體的生長曲線。從YEPD斜面上挑取1環酵母菌接入裝液量為50 mL/250 mL YEPD中，30℃靜置培養12 h。然后按照10%的比例接入裝液量為100 mL/500 mL YEPD的三角瓶中，30℃靜置培養，每隔2 h取出1 mL菌液，5 000 r/min離心5 min，棄清液，蒸餾水洗滌兩次后，稀釋到最終的OD600nm值在1以內。以蒸餾水為空白對照，測定其在波長600 nm處的吸光度值。

1.3.4 CO2排放量、還原糖、酒精度的測定

CO2排放量、還原糖和酒精度的測定分別采用稱重法、斐林試劑法和酒精計比重法[14]。

1.3.5 乙酸乙酯的測定

發酵結束后蒸餾發酵液得到含有乙酸乙酯的待測樣品，采用GC法檢測乙酸乙酯的含量[15]。檢測條件為：Agilent 1909N-213毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；檢測器為火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，FID）；進樣口的溫度設置為200℃；檢測器的溫度為200℃；進樣量為1 μL；分流比為5∶1；載氣為高純度氮氣（N2），流速為2.0 mL/min。升溫程序：起始柱溫設置為50℃，保持8 min，再以5℃/min的升溫速度上升至120℃，保持5 min。

1.3.6 乙酰輔酶A含量的測定

樣品制備：取10mL發酵液以8000r/min、4℃離心10min，0.25 mol/L pH 5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）1 mL洗兩次，8 000 r/min、4℃離心10 min，去上清，用1 mL 6%高氯酸重懸，逐滴加入0.3 mol/L的碳酸鉀溶液進行鹽沉淀（添加的過程中漩渦振蕩使其充分混勻），調節pH值為3.0，12 000 r/min、4 ℃離心10 min除去高氯酸鉀（KClO4）晶體。

上清液轉移到EP管中，用0.22 μm針頭式過濾器過濾，然后進行乙酰輔酶A含量的高效液相色譜法分析，其檢測條件[16]為：ZORBAX Eclipse PlusC18色譜柱（250m×4.6 mm×5 μm）；流動相為0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液（A）90%和乙腈（B）10%；流速1 mL/min；柱溫25℃；紫外檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

1.3.7 乙酰輔酶A合成酶酶活的測定

乙酰輔酶A合成酶活力的測定參考KUANG Y等[17]的方法，反應混合液（1 mL）包含100 μmol Tris-HCl緩沖液（pH8.0），5μmol1-萘乙酰胺（1-naphthaleneacetamide，NAD）+，0.1 μmol CoA，5 μmol蘋果酸，150 U蘋果酸脫氫酶，2.75 U檸檬酸合酶，10 μmol乙酸鉀，10 μmol三磷酸腺苷ATP以及適量的粗酶液，30℃反應（反應時間20 min），測定在波長340 nm處吸光度值的變化。

乙酰輔酶A酶合成酶活力定義：每分鐘催化底物生成1 μmol的NADH為1個酶活力單位（U）。

1.3.8 重組菌株的表達

從YEPD斜面上挑取1環突變菌種分別接入含5 mL一級種子培養基的試管中，30℃靜置培養24 h，進入穩定期后，按照10%的接種量將其接種到含45 mL二級種子培養基中，30℃靜置培養16～17 h，按照10%接種量接種到發酵培養基，不添加前體乙醇和乙酸，30℃靜置發酵96 h，每隔12 h稱質量1次，發酵結束后測定CO2排放量、酒精度、發酵液殘余還原糖、乙酸乙酯的含量、乙酰輔酶A含量及乙酰輔酶A合成酶酶活，每個樣品做3個平行，取平均值。

2 結果與分析

2.1 ACH1基因缺失對乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量的影響

出發菌株α5和突變株α5ΔACH1用發酵培養基進行發酵，不添加酒精和乙酸，發酵96 h后，測定發酵液中乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量，結果如圖3所示。由圖3可知，突變株α5ΔACH1乙酸乙酯生成量為11.90 mg/L，比出發菌株α5增加了10.59%；突變株α5ΔACH1的乙酰輔酶A含量比出發菌株α5增加了52.5%。結果表明，ACH1基因缺失可以減少乙酰輔酶A的分解，從而提高乙酸乙酯的產量。

圖3 突變株α5ΔACH1和出發菌株α5乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量Fig.3 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of mutant strain α5ΔACH1 and original strain α5

2.2 過表達ACS1和ACS2基因對乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量的影響

（1）生長曲線的測定

測定出發菌株α5和重組菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2的生長曲線，結果如圖4所示。由圖4可知，重組菌株α5-A1與出發菌株α5的生長速率基本一致。菌株α5-A2表現出最高的生長速度和生物量，最大生物量為OD600nm值為17.60，菌株α5ΔACH1的最終生物量低于出發菌株，說明ACH1基因敲除影響酵母菌株的正常生長。

圖4 菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2和α5的生長曲線Fig.4 Growth curves of strain α5ΔACH1,α5-A1,α5-A2 and α5

（2）乙酸乙酯及乙酰輔酶A含量的測定

將出發菌株α5和重組菌株α5-A1和α5-A2用發酵培養基進行發酵，發酵96 h后，測定菌株乙酸乙酯的生成量和乙酰輔酶A含量，并用雙尾t檢驗進行統計學分析，結果如圖5所示。由圖5可知，重組菌株α5-A1和α5-A2的乙酸乙酯產量分別為13.57mg/L和13.31mg/L，分別比突變菌株α5ΔACH1提高14.03%和11.85%，比出發菌株α5增加26.12%和23.70%。結果表明，過表達ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母細胞中乙酸乙酯的合成，且ACS1基因比ACS2基因的過表達更有利于乙酸乙酯含量的提高。

圖5 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量Fig.5 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

突變株α5-A1和α5-A2乙酰輔酶A含量比突變株α5ΔACH1分別提高了80.33%和52.79%，比出發菌株α5分別提高了175.00%和133.25%。結果表明，工程菌株過表達ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母細胞中乙酰輔酶A含量。

（3）基因表達水平及乙酰輔酶A合成酶酶活力測定

為了分析重組菌株中ACS1和ACS2基因的轉錄水平，分別測定了出發菌株α5和重組菌株α5-A1和α5-A2的基因轉錄水平差異，結果如圖6所示。由圖6可知，在重組菌株α5-A1中，ACS1基因的表達水平是出發菌株α5的3.3倍，在重組菌株α5-A2中，ACS2基因的表達水平是出發菌株α5的1.9倍。結果表明，過表達ACS1和ACS2基因均提高了其轉錄水平。

在轉錄水平提高的基礎上，進一步測定了菌株α5和重組菌α5-A1和α5-A2的乙酰輔酶A合成酶的酶活力，結果如圖6所示。由圖6可知，重組菌株α5-A1和α5-A2的乙酰輔酶A合成酶酶活分別比出發菌株α5提高了1.5倍和1.2倍。結果表明，過表達ACS1和ACS2基因后，乙酰輔酶A合成酶酶活均提高，且過表達ACS1比過表達ACS2基因的酶活高。

圖6 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2基因表達水平和乙酰輔酶A合成酶酶活Fig.6 Gene expression levels and acetyl-CoA synthesis activity of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

2.3 過表達ATF1基因對乙酸乙酯生成量的影響

（1）CO2排放量、還原糖和酒精度的測定

將過表達ATF1基因的 菌 株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1，以及親本菌株α5在發酵培養基中發酵，發酵96 h后測定CO2排放量、還原糖和酒精度，結果見表2。由表2可知，在相同發酵條件下，與出發菌株α5相比，除α5-ATF1的CO2排放量外，其他重組菌的CO2排放量、還原糖和酒精度基本無太大的變化，結果表明，過表達ATF1基因對菌株的發酵性能基本沒有明顯的影響。

表2 出發菌株和重組菌株發酵性能的比較Table 2 Comparison of the fermentation performance of the original strain and recombination strains

（2）乙酸乙酯生成量的測定

出發菌株與重組菌株乙酸乙酯的生成量測定結果如圖7所示。由圖7可知，單獨過表達ATF1基因α5-ATF1菌株產生的乙酸乙酯為對照菌株α5的315.09%，重組菌A1-ATF1乙酸乙酯生成量最高，達到72.52 mg/L，是重組菌α5-ATF1的204.14%，重組菌A2-ATF1乙酸乙酯生成量為44.80 mg/L，是重組菌α5-ATF1的125.67%，重組菌重組菌ΔA-ATF1比α5-ATF1產乙酸乙酯顯著增加。由此可以得出，在提高乙酰輔酶A的基礎上，進一步增加醇乙?；D移酶的活性，可顯著提高乙酸乙酯生成量。

圖7 過表達ATF1基因菌株乙酸乙酯生成量Fig.7 Ethyl acetate content of the strains with overexpression of ATF1gene

3 結論

乙酸乙酯是清香型白酒的主體香，一直備受關注。本研究通過基因工程手段提高釀酒酵母分泌乙酰輔酶A的能力，從而提高乙酸乙酯生成量。通過ACH1基因缺失的α5ΔACH1菌株表達發現，乙酰輔酶A含量較親本菌株α5稍有提高，但對提高乙酸乙酯生成量的效果并不明顯，分析原因可能是ACH1基因定位于線粒體中，其增加的是線粒體中乙酰輔酶A的含量，線粒體中的乙酰輔酶A無法流向乙酸乙酯的合成。在ACH1基因缺失的基礎上，過表達ACS1和ACS2基因得到工程菌株α5-A1和α5-A2，乙酸乙酯生成量分別比親本菌株α5提高26.12%和23.70%；乙酰輔酶A含量分別比α5ΔACH1提高了80.33%和52.79%；結果表明，過表達ACS1和ACS2基因均能提高乙酰輔酶A含量和乙酸乙酯生成量，且乙酸乙酯生成量和胞內乙酰輔酶A的增加量呈正相關。在過表達ACS1和ACS2基因的基礎上，過表達醇乙?；D移酶ATF1基因得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1，乙酸乙酯含量分別為72.52mg/L和44.80mg/L，分別是單獨過表達ATF1基因a5-ATF1的204.14%和125.67%，且ΔA-ATF1比α5-ATF1產乙酸乙酯顯著增加，結果表明，在底物乙酰輔酶A充足的條件下，提高醇乙?；D移酶活性，能夠提高乙酸乙酯的生成量。本研究為后續研究釀酒酵母乙酸乙酯的合成奠定了基礎。

[1]XING M,WU Q,LI W,et al.Improving flavor metabolism ofSaccha

romyces cerevisiaeby mixed culture withBacillus licheniformisfor Chi-nese Maotai-flavor liquor making[J].J Ind Microbiol Biotech,2015,42(12):1601-1608.

2]WU Q,YU K,YAN X.Flavor profile of Chinese liquor is altered by interactions of intrinsic and extrinsic microbes[J].Appl Environ Microbiol,2015,82(2):422-430.

3]NORDSTORM K.Formation of esters from alcohols by brewer's yeast[J].J Inst Brew,1964,70(4):328-336.

4]KLEIN H P,JAHNKE L.Effects of aeration on formation and localization of the acetyl coenzyme A synthetases ofSaccharomyces cerevisiae[J].J Bacteriol,1979,137(1):179-184.

5]LEE F J,LIN L W,SMITH J A.Acetyl-CoA hydrolase involved in acetate utilization inSaccharomyces cerevisiae[J].Biochim Biophy Acta,1996,1297(1):105-109.

6]鐘姝霞，萬世旅，邊名鴻，等.一株高產乙酸乙酯酵母的鑒定及產酯條件的研究[J].中國釀造，2017，36（2）：75-79.

7]LI W,WANG J H,ZHANG C Y,et al.Regulation ofSaccharomyces cerevisiaegenetic engineering on the production of acetate esters and higher alcohols during ChineseBaijiufermentation[J].J Ind Microbiol Biot,2017,44(6):949-960.

8]ZHANG J W,ZHANG C Y,DAI L H,et al.Effects of overexpression of the alcohol acetyltransferase-encoding geneATF1,and disruption of the esterase-encoding geneIAH1,on the flavour profiles of Chinese yellow rice wine[J].Int J Food Sci Technol,2012,47(12):2590-2596.

9]YOSHIMOTO H,FUJIWARA D,MOMMA T,et al.Isolation and characterization of theATF2gene encoding alcohol acetyltransferase II in the bottom fermenting yeastSaccharomyces pastorianus[J].Yeast,1999,15(5):409-417.

[10]YOSHIMOTO H,FUJIWARA D,MOMMA T,et al.Characterization ofthe ATF1,and Lg-ATF1,genes encoding alcohol acetyltransferases in the bottom fermenting yeastSaccharomyces pastorianus[J].J Ferment Bioeng,1999,86(5):409-417.

[11]NAGASAWA N,BOGAKI T,IWAMATSU A,et al.Cloning and nucleotide sequence of the alcohol acetyltransferase II Gene(ATF2)fromSaccharomyces cerevisiaeKyokai No.7[J].Biosci Biotechnol Biochem,1998,62(10):1852-1857.

[12]DONG J,XU H,ZHAO L,et al.Enhanced acetate ester production of Chinese liquor yeast by overexpressingATF1through precise and seamless insertion of PGK1 promoter[J].J Ind Microbiol Biot,2014,41(12):1823-1828.

[13]ZHANG C Y,LIU Y L,QI Y N,et al.Increased esters and decreased higher alcohols production by engineered brewer's yeast strains[J].Eur Food Res Technol,2013,236(6):1009-1014.

[14]李 箏，韓北忠，陳晶瑜，等.優良釀酒酵母菌的發酵性能研究[J].中國釀造，2008，27（19）：10-12.

[15]鄭建滉，丁慶華，吳 娜.GC法檢測泰樂菌素中殘留乙酸乙酯的含量[J].中國獸藥雜志，2013，47（8）：49-51.

[16]李培照，李 春，梁婉婷，等.高效液相色譜法（HPLC）測定保加利亞乳桿菌胞內 Acetyl-CoA[J].食品工業科技，2013，34（22）：58-61.

[17]KUANG Y,SALEM N,WANG F,et al.A colorimetric assay method to measure acetyl-coa synthetase activity:application to woodchuck model ofhepatitisvirus-induced hepatocellular carcinoma[J].J Biochem Biophys Meth,2007,70(4):649-55.