菌株F21來源α-淀粉酶的酶學性質研究1

郭宏文1，2，徐婷婷1，2，劉曉蘭1，2，姜未公1，馬瑞1

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

在酶制劑工業中，α-淀粉酶是最早實現工業化生產且用途最廣、產量最大的酶制劑品種，幾乎占淀粉酶制劑總產量的50%以上[1]。通常，中性α-淀粉酶的最適pH范圍為6.0～8.0，而酸性α-淀粉酶最適pH范圍為4.0～6.0。與中性α-淀粉酶相比，酸性α-淀粉酶能夠在酸性條件下水解淀粉，保持高活性。憑借它的優勢，酸性α-淀粉酶在食品加工、釀造發酵、制糖、紡織、造紙、醫藥和飼料等工業領域的應用日益廣泛[2-4]。目前工業應用的α-淀粉酶主要來源于細菌和絲狀真菌[5-6]，生產酸性α-淀粉酶的菌株則主要為黑曲霉和枯草芽孢桿菌[7-8]。研究和開發新型的酸性α-淀粉酶具有極高的社會經濟價值。近年來，國內學者在開發新型的酸性α-淀粉酶方面開展了一些研究，如屈建航等[9]篩選到產α-淀粉酶的酵母菌菌株SH3，所產α-淀粉酶的最適pH值為5.0，最適溫度為50℃。權淑靜等[10]對黑曲霉菌株A-5-3所產α-淀粉酶進行了酶性質研究，酶的最適pH值為3.6，最適溫度為70℃，具有很好的酸穩定性且為非Ca2+依賴型水解酶。本研究對實驗室從白酒廠的酒醅中分離篩選的產α-淀粉酶菌株F21進行誘變選育[11]，并對其所產的α-淀粉酶進行純化和酶學性質研究，為開發新型的酸性α-淀粉酶在酶的純化方面提供一些基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）F21：本實驗室從酒醅中分離并經誘變選育得到。

1.1.2 培養基[12]

菌種保藏培養基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

產酶種子培養基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

產酶發酵培養基：玉米淀粉2.0 g，豆餅粉1.5 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

快速辛基-瓊脂糖凝膠（OctylSepharoseFastFlow）填料：美國Amersham Biosciences公司；硫酸銨（色譜純）：生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；HYG-III回轉式恒溫調速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備公司；CR21GⅢ日立高速冷凍離心機：天美（中國）科學儀器有限公司；AKTAPrime蛋白純化系統：美國GE公司；Octyl-Sepharose Fast Flow層析柱（1.6 cm×20 cm）：上海錦華層析設備廠。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

菌株的活化：將菌種接種到斜面培養基，在37℃的培養箱中培養24 h。

種子液制備：活化后的菌種接入裝有25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，于36℃、180 r/min條件下的搖床中培養18 h。

發酵液制備：取2.4mL種子液接種到裝有30mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，在40℃，200 r/min的搖床中培養48 h。

粗酶液制備：發酵液經四層紗布過濾后，在8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液備用。

1.3.2 蛋白含量的測定

參見Folin-酚試劑法（Lowry法）[13]測定蛋白含量。

1.3.3α-淀粉酶活測定

參見YOO J Y等[14-15]的方法測定α-淀粉酶活。

α-淀粉酶活定義：在pH 4.6、溫度60℃條件下，5 min水解1mg可溶性淀粉（0.5%）所需的酶量為一個活力單位（U）。

相對酶活：酶活與相同反應條件下酶活最大值的比值（%）。

酶比活力：酶活與蛋白濃度的比值，用每毫克蛋白所含的酶活力單位數表示（U/mg）。

1.3.4 硫酸銨鹽析

將5 mL上清液裝入離心管中，在4℃條件下，分別緩慢加入飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨，4℃靜置過夜，經10 000 r/min冷凍離心20 min后，收集各管中的沉淀，測定不同硫酸銨飽和度條件下對應的蛋白濃度和α-淀粉酶活，繪制鹽析曲線[16]。

1.3.5 Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析

色譜方法及條件：平衡液為飽和度40%的硫酸銨溶液；洗脫液使用0.02 mol/L pH7.0磷酸緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS）；流速為2mL/min；上樣量為15mL。樣品上樣后先用120 mL飽和度為40%的硫酸銨沖洗，然后用120 mL飽和度為40%的硫酸銨和等體積的0.02 mol/L pH7.0 PBS進行梯度洗脫（洗脫液中硫酸銨飽和度40%～0%），最后用0.02 mol/LpH 7.0 PBS洗脫，用自動部分收集器定時收集3 mL/管，檢測各管收集液的蛋白吸光度值及α-淀粉酶活，收集酶活高的洗脫液[16]。

1.3.6 酶學性質研究

最適反應pH：采用pH為3.5～10.5的不同緩沖液配制反應體系，于55℃條件反應，并計算相對酶活力。

最適反應溫度：酶反應體系于35～90℃條件下進行反應，并計算相對酶活力。

pH穩定性：酶液分別在不同pH（3.5～10.5）條件下處理1 h后進行酶反應，測定相對酶活。

溫度穩定性：酶液分別在不同溫度（35～90℃）條件下處理1 h后進行酶反應，測定相對酶活。

不同金屬離子對酶活的影響：酶反應體系中添加0.5 mmol/L不同種類的金屬離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））后，于最適pH和溫度條件下進行酶反應，測定相對酶活。

1.3.7 數據處理

實驗數據均為3次平行實驗結果的平均值，圖利用Excel軟件進行數據處理得到。

2 結果

2.1 硫酸銨鹽析

采用不同飽和度的硫酸銨對粗酶液進行鹽析，測定硫酸銨沉淀中的蛋白濃度及酶活，制作鹽析曲線，結果如圖1所示。

圖1 硫酸銨鹽析曲線Fig.1 The curve of ammonium sulfate fractionation

由圖1可知，硫酸銨飽和度低于40%時，目的酶蛋白沉淀的量很少，飽和度在40%～60%時，目的酶蛋白隨硫酸銨量的增加開始大量析出，酶活同時迅速增大。當飽和度超過60%時，目的酶蛋白的析出量增加很少，酶活增加很小，而雜蛋白仍大量析出。硫酸銨飽和度為50%、60%和70%時酶活分別為804.7 U/mL、1 053.2 U/mL和1 115.5 U/mL。計算了各飽和度目的酶蛋白的比活力，50%飽和度的比活力為1 826.7，60%飽和度的比活力為1 617.6，70%飽和度的比活力1 173.0。綜合考慮比活力及酶活，為了達到較好純化效果而又減少酶活的損失。因此，選擇使用60%飽和度的硫酸銨對發酵液進行鹽析以沉淀回收目的酶蛋白。

2.2 Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析

測定不同收集液的OD280nm值和酶活，制作疏水層析曲線，結果如圖2所示。

圖2 Octyl-Sepharose F F疏水層析曲線Fig.2 The elution curve of Octyl-Sepharose Fast Flow Hydrophobic chromatography

由圖2可知，共出現三個蛋白峰，第一個峰在沖冼的階段，是沒有被疏水分離介質吸附上的蛋白質，峰值最大，OD280nm值為1.565，蛋白量最多。第二個峰在梯度洗脫過程中出現，是吸附在分離介質上的被一定濃度的PBS洗脫下來的部分蛋白，其峰值小，OD280nm值為0.432，蛋白含量少。第三個峰出現在用無硫酸銨的PBS沖洗的階段，峰值最小，是吸附在分離介質上的結合力最強的少量蛋白。分別測定這三個蛋白峰對應的各管酶活，僅第一個峰有酶活，活性峰與蛋白峰幾乎重合。說明酶沒能被分離介質所吸附，在第一階段被緩沖液洗下。而第二、第三個峰的蛋白均無酶活，屬于雜蛋白峰。通過本次疏水層析達到了一定的純化效果，去除了酶液中被疏水分離介質吸附的雜蛋白。

2.3 α-淀粉酶純化結果

粗酶液、60%飽和度的硫酸銨對發酵液進行鹽析沉淀后用蒸餾水溶解及Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析洗脫液中各指標的測定結果見表1。

表1 a-淀粉酶的純化結果Table 1 Purification results of α-amylase

2.4 酶學性質研究

2.4.1 酶反應最適pH及pH穩定性

不同pH對酶活的影響及pH穩定性結果見圖3。由圖3可知，酶在pH4.8時反應的活力最大，酶反應的最適pH值為4.8，在酸性條件pH 4.5～6.0范圍內酶反應活力較高，相對酶活在75%以上。在中性條件pH 7.0條件下，相對酶活為66.2%，在堿性條件酶反應仍保持較高的活力，pH 9.0時的相對酶活為60.9%，pH10時的相對酶活為53.9%。結果表明，酶在pH 4.0～9.0的范圍內相對穩定，相對酶活保持在90%以上，且在酸性環境pH 4.5條件下最為穩定。酶在pH 4.0條件下的相對酶活為91.8%，pH5.0條件下的相對酶活為98.2%，可見，該酶具有較好的耐酸性。

圖3 反應pH對酶活性的影響及酶的pH穩定性Fig.3 Effect of reaction pH on enzyme activity and pH stability of enzyme

2.4.2 酶反應最適溫度及熱穩定性

不同反應溫度對酶活的影響及酶的熱穩定性結果見圖4。由圖4可知，酶反應溫度為55℃時的活力最大，酶反應的最適溫度為55℃。酶在50～65℃范圍內反應具有較高活力，相對酶活在90%以上。當溫度大于75℃時酶活急劇下降，75℃酶反應時的相對酶活為76.9%，90℃酶反應時的相對酶活只有44.1%。酶的熱穩定性研究結果為，酶在35℃條件下最穩定，在溫度低于45℃的條件下比較穩定，活力保持在35℃時酶活的90%以上，在高于60℃的條件下酶迅速失活，60℃條件下的殘余酶活為65.5%，75℃條件下的殘余酶活只有8.9%。

圖4 反應溫度對酶活性的影響及酶的熱穩定性Fig.4 Effect reaction temperature of enzyme activity and temperature stability

2.4.3 金屬離子對酶活的影響

以不添加金屬離子時的酶活為對照，金屬離子對酶活的影響結果見圖5。由圖5可知，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+對酶活有激活作用，其中Ca2+對酶的活性激活作用較強，活力比對照提高了17.8%。其余金屬離子對酶的活性有一定的抑制作用，其中Fe2+和Fe3+的抑制作用較強，活力只為對照的88.2%和89.2%。

圖5 不同金屬離子對酶活的影響Fig.5 Effect of different metal ions on enzyme activity

3 結論

本研究采用硫酸銨鹽析和疏水作用層析對菌株F21所產的α-淀粉酶粗酶液進行純化并對其進行酶學性質研究。研究發現，該α-淀粉酶反應的最適溫度為55℃，最適pH值為4.8，屬于一種中溫酸性α-淀粉酶。酶在pH 4.0～9.0及低于45℃的環境下比較穩定。Ca2+對酶的活性有較強的激活作用，Fe2+及Fe3+對酶的活性有較強的抑制作用。該α-淀粉酶對鈣離子有依賴性，這與文獻報道的多種酸性α-淀粉酶的特點是一致的。該α-淀粉酶穩定存在的pH范圍廣范，具有較好耐酸性的同時，在中性及偏堿性條件下也比較穩定，且在中性及偏堿性條件下的酶活仍保持在酸性條件下酶活的60%以上，使該酶具有一定的研究開發價值。

[1]孟憲梅，杜 承，秦亞楠.耐高溫α-淀粉酶的分子生物學研究進展[J].吉林工商學院學報，2010，26（5）：41-43.

[2]Reddy N S，Nimmagadda A，Sambasiva Rao K R S.An overview of the microbial α-amylase family[J].Afr J Biotechnol.2003，2（12）：645-648.

[3]Kalpana Bandian S K.Halotolerant，acid-alkali stable，chelator resistant and raw starch digesting α-amylase from a marine bacterium Bacillus subtilis S8-18[J].J Basic Microbiol，2014，54（8）：802-811.

[4]賈冬梅，華曉曼，王玉華.耐酸性α-淀粉酶研究進展[J].食品科技，2016，41（10）：224-227.

[5]Gupta R，Gigras P，Mohapatra H，et al.Microbial α-amylases：a biotechnologicalperspective[J].ProcessBiochemistry，2003，38（11）：1599-1616.

[6]李 松，王正祥.真菌α-淀粉酶的研究進展[J].生物技術通報，2011，27（3）：66-70.

[7]Sharma A，Satyanarayana T.Microbial acid-stable α-amylases：Characteristics，genetic engineering and applications[J].Process Biochem，2013，48（2）：201-211.

[8]石方方，焦國寶，丁長河，等.耐酸耐高溫α-淀粉酶的研究進展[J].中國食品添加劑，2014，（4）：171-176.

[9]屈建航，尹 伊，焦國寶，等.酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發酵條件研究[J].生物技術通報，2015，31（7）：188-192.

[10]權淑靜，解復紅，馬 煥，等.一株產酸性α-淀粉酶菌株的篩選及酶學性質研究[J].中國釀造，2014，33（5）：104-108.

[11]郭宏文，王 艷，江成英，等.酸性α-淀粉酶菌種的誘變選育[J].江蘇農業科學，2016，44（3）：356-357.

[12]郭宏文，江成英，王 路，等.酸性α-淀粉酶菌種產酶條件的優化[J].江蘇農業科學，2017，45（21）：308-310.

[13]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術[M].北京：高等教育出版社，2002：137-138.

[14]Yoo Y J，Hong J，Hatch R T.Comparison of α-amylase activities from different assay methods[J].Biotechnology and Bioengineering，1987，30（11）：147-151.

[15]史永昶，姜涌明，樊 飚，等.蛋白酶對解粉芽孢桿菌α-淀粉酶活力的影響[J].微生物學通報，1995，22（1）：23-25.

[16]江成英，吳耘紅.生物工程實驗原理與技術[M].大連：大連理工大學出版社，2013：331-346.