MicroRNA-4270在肝癌血漿和組織中的檢測結果及分析

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(1.南華大學附屬南華醫院消化內科，湖南 衡陽421001；2.南華大學醫學院轉化醫學研究室；3.南華大學附屬南華醫院腫瘤內科)

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均高，因此如何提高肝癌患者的早期診治率成為近年來研究的熱點和難點。MicroRNA是一種長度約為19～23個核苷酸的單鏈RNA，參與人體的生理病理過程[1]，在惡性腫瘤的發展中扮演著抑癌基因或致癌基因的角色，有助于癌癥的診斷。目前有許多關于研究microRNA在各領域方面的報道[2-4]。例如microRNA-423可增強肝癌細胞的侵襲力，在肝癌細胞中與BRSM1的表達呈負相關，有可能作為肝癌藥物治療的潛在靶點[5]。但是目前關于肝癌與miR-4270的關系報道幾乎沒有，本文主要先通過基因芯片初篩選取miR-4270作為研究對象，以血漿及組織標本為生物樣本，檢測miR-4270表達量，并分析其與肝癌診斷的相關性，從而為miR-4270可能成為潛在的腫瘤生物學標志物提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1病例選擇血漿樣本選取2015年6月～2016年12月在南華大學附屬第一醫院及附屬南華醫院住院治療的肝癌患者30例及門診健康體檢者30例。組織標本選擇2014年1月～2016年12月在中南大學湘雅二醫院確診的肝癌患者癌組織40例及癌旁組織20例。選擇標準：①經過彩超、腹部增強CT、AFP等臨床資料，結合患者病史和癥狀，并經過病理組織切片結果確診為肝癌，且原發灶為肝臟，排除其他部位惡性腫瘤所導致的轉移性肝癌。②正常人血清為門診體檢患者，排除其他心、肺、腦、內分泌等方面的疾病。③癌旁組織為通過組織活檢確診為肝癌患者的遠癌旁組織切片。肝癌的癌組織及癌旁組織標本于術中離體后1 h內取樣，取樣后組織經脫水、滲透，最后進行石蠟包埋。④實驗前均取得所有試驗對象的知情同意。

1.2方法

1.2.1 血漿中總RNA的提取 離心血漿樣本，取上層液體200 μL，并加入1 000 μL的裂解液，嚴格按照miRNeasy Plasma試劑盒操作流程提取RNA。

1.2.2 血漿中cDNA的合成 將提取的血漿RNA取3 μL做模板，參照miScript II RT Kit試劑盒上操作流程，加入5×miScript HiSpec Buffer 4 μL、10×miScript Nucleics Mix 2 μL、RNase-free water 9 μL、miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，組成20 μL的反應體系，逆轉錄得到cDNA。向完成逆轉錄反應體系中，加入200 μL的RNase-free water(無酶水)稀釋，并暫時冷保存于-20 ℃中。

1.2.3 組織樣本總RNA的提取 溶解石蠟組織，利用miRNeasy FFPE kit(50)試劑，并嚴格按照試劑操作流程提取RNA。

1.2.4 組織樣本cDNA的合成 利用提取的組織RNA取3 μL做模板，參照miScript II RT Kit試劑盒上操作流程，加入試劑組成20 μL的反應體系，逆轉錄得到cDNA，最后加入100 μL的RNase-free water(無酶水)稀釋，并暫時冷保存于-20 ℃中。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 利用逆轉錄得到的cDNA,使用熒光定量檢測儀試劑盒，嚴格按照操作流程，每個樣本做3個平行對照孔，行PCR檢測，每個樣本取平行孔的平均值進行計算。本實驗采用2-Δct表示目的基因的相對表達量，同時利用內參進行數據的標準化對照。

1.3統計學分析統計學分析采用SPSS 18.0統計軟件進行。其中數據分析以均數±標準差，使用獨立樣本t檢驗。可信區間為95%，P<0.05表示差異具有統計學意義。兩個樣本之間的相關性比較先檢驗是否服從正態分布，服從正態分布使用T檢驗，不服從正態分布的兩組樣本采用非參數相關系數分析(Spearman Correlation),|r|<1，r>0為正相關，r<0負相關，r=0為零相關，P<0.05表示差異具有統計學意義。應用GraphPad Prism繪制柱狀圖和生存曲線圖。

2 結 果

2.1 miR-4270在血漿中的表達量30例肝癌患者血漿中的相對表達量為6.1±6.5，正常人血漿中miRNA-4270的相對表達量是2.7±1.7。miRNA-4270在肝癌患者血清中的表達量明顯高于正常人(P<0.05)。見圖1。

圖1 microRNA-4270在正常人和肝癌患者的血漿表達量與正常人比較，*P<0.05

2.2 miR-4270在組織中的表達量40例肝癌患者癌組織切片中的相對表達量為11.7±18.7，癌旁組織中miRNA-4270的相對表達量是1.0±1.2。miRNA-4270在肝癌患者組織中的表達量明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-4270在肝癌組織及癌旁對照組織中的表達量與癌旁組織比較，*P<0.05

2.3 miR-4270表達量對原發性肝癌的診斷意義通過繪制ROC曲線(圖3、圖4)，可以得出，在血漿中，ROC曲線下面積為0.652，95%可信區間為0.508～0.796(P<0.05)，此時靈敏度和特異度均一般，靈敏度為63.3%，特異度為63.3%。在肝癌組織標本中，ROC曲線下面積為0.828，95%可信區間為0.723～0.932(P<0.05)，此時靈敏度及特異度均稍高，靈敏度為80%，特異度為80%。提示miR-4270的檢測對肝癌的初步診斷具有重要的價值。

圖3 血漿中miRNA-4270相對表達量的ROC曲線分析

圖4 組織中miRNA-4270相對表達量的ROC曲線分析

2.4 miR-4270表達水平與臨床相關因素的關系分析通過統計分析發現，在年齡、性別、腫塊大小、腫瘤分期、AFP水平及病毒定量因素中，肝癌患者的miR-4270的相對表達量與患者臨床資料之間無統計學意義(P>0.05)。見表1、表2。

2.5 miR-4270表達水平與AFP的相關性分析根據SPSS 18.0統計軟件進行分析，miR-4270表達量與AFP含量不服從正態分布，故使用spearman相關分析，在血漿中，rs=0.64，P=0.736，在組織標本中，rs=0.104，P=0.530，此時P值均大于0.05，說明microRNA-4270表達量與AFP水平沒有相關性，可作為診斷肝癌的獨立診斷標準。

根據SPSS 18.0統計軟件進行分析，將肝癌患者AFP水平分為大于400 μg/L與小于400 μg/L,把AFP<400μg/L的患者與正常人患者相對比，AFP<400 μg/L的肝癌患者表達量高于正常人(P<0.05)。見表3、表4。

表1 血漿樣本中miRNA-4270表達量與肝癌臨床資料相關性分析

表2 組織樣本中miR-4270表達量與肝癌臨床資料相關性分析

表3 血漿中AFP<400 μg/L肝癌患者與正常人miR-4270相對表達量

表4 組織中AFP<400 μg/L肝癌患者與正常人miR-4270相對表達量

2.6 miR-4270表達量與肝癌患者預后關系通過電話及門診隨訪，將血漿標本和癌組織標本中肝癌患者的生存預后與miRNA-4270的表達量分別進行了統計分析。同時，將miR-4270表達量根據平均值分為低表達組(表達量小于平均值)與高表達組(表達量大于平均值)，實驗發現，無論在血漿中還是在癌組織中，miRNA-4270表達量越高的患者反而生存越短，表達量低者生存期越長，P<0.05(圖5、圖6)。

圖5 血漿標本肝癌患者miRNA生存期限圖

圖6 組織標本肝癌患者miRNA生存期限

3 討 論

流行病學調查發現，肝癌的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是危害人類健康的重大疾病。傳統的治療包括早期的手術切除、酒精射頻消融、經動脈血管栓塞術[6]，有最新報道研究，磁熱療法、索拉非尼藥物化療法也逐漸用于肝癌的治療[7-8]。然而，肝癌起病隱匿，缺乏早期典型癥狀，臨床癥狀明顯者，病情大多已進入中晚期，缺乏有效的治療方案，且晚期并發癥多，嚴重影響患者生活質量，早期診斷發現對腫瘤患者很重要。在2017年中國《原發性肝癌診療規范》中，動態增強CT及MRI、超聲影像、普美顯動態增強MRI這四項檢查成為診斷肝癌的特殊手段，其中AFP更是作為一項常規篩查的重要指標[9]。趙亞靜等[10]研究發現，血清AFU(a-L巖藻糖苷酶)較AFP敏感性更高，兩者聯合，更能提高診斷精準率。

目前肝癌的致病作用尚未被完全闡明，但大量研究證明，與DNA的損傷、染色體的變異、抑癌基因的滅活與致癌基因的活化密不可分。MicroRNA是一類非編碼單鏈 RNA，在人類表達有近千條，主要通過與宿主mRNA(信使RNA)結合從而發揮生物學效應。MicroRNA let-7 家族是最早發現的 microRNA 之一，作為腫瘤抑制基因，經常在人類各種惡性腫瘤中被滅活。相當多的證據表明,microRNA let-7 表達下調可能與癌癥患者臨床療效不佳有關[11]。MicroRNA作為肝癌的調節因子，在肝癌的發生發展中起重要作用。研究顯示，這些microRNA大致可分為兩種類型[12]，一種為“肝臟特異性表達”，是指僅在肝臟組織中呈異常性表達，如 miR-122，它是肝癌中最豐富和最特定的microRNA，在肝臟中表達為上調，主要通過調節目的基因來抑制肝細胞癌；另一種為“非肝臟特異性表達”,是指在多種細胞中均可出現異常表達，如最早發現的let-7 家族，在乳腺癌、肝癌、肺癌中均有表達異常[13]。

本研究實驗前期進行基因芯片初篩，考慮目前還沒有關于miRNA-4270和肝癌之間關系的研究報道，選取microRNA-4270作為目標RNA。研究表明，無論是在血漿中還是組織中，肝癌患者miR-4270表達量較正常人均明顯上調，差異有統計學意義。同時ROC曲線分析表明miR-4270檢測對于原發性肝癌患者的敏感度和特異度均較高，可作為肝癌的輔助診斷之一。此外，本研究還發現miR-4270的表達量與患者臨床資料并無顯著相關性，但是，對于部分AFP<400 μg/L的肝癌患者中，miR-4270的表達量明顯高于正常人，這提示在肝癌早期階段或者對于那些 AFP<400 μg/L 的患者中，通過檢測血清中 miRNA-4270的表達量，可以發現潛在的肝癌風險。而且，生存曲線分析表明miR-4270高表達者反而有更短的生存期，更加驗證了miR-4270可能作為致癌基因的存在。

綜合本研究證明，microRNA-4270表達水平與正常人相比明顯上調，統計上存在顯著性差異，而且，在對于早期AFP<400 μg/L的肝癌患者，miR-4270明顯升高，提示對肝癌早期鑒別診斷、病情監測具有重要借鑒作用，為治療方案選擇提供科學依據。

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