山姜素抑制卵巢癌OVCAR—8細胞增殖遷移及其機制研究

曾靜 王璟 殷金鳳 宋琦

[摘要] 目的 探討山姜素對人卵巢癌OVCAR-8細胞的增殖、遷移的抑制作用及其可能機制。 方法 以DMSO為溶劑對照，使用不同濃度山姜素（25、50、100、200和400 μmol/L）處理OVCAR-8不同時間（24、48和72 h）后，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活力；采用3D腫瘤微球形成實驗檢測50 μmol/L山姜素處理7 d后腫瘤微球形成能力；使用劃痕實驗檢測100 μmol/L山姜素處理24 h后對遷移能力；采用Western blot法檢測不同濃度山姜素（50、100和200 μmol/L，以DMSO為對照）作用48 h后OVCAR-8細胞STAT3信號通路及凋亡相關蛋白表達變化。 結果 25～400 μmol/L山姜素對OVCAR-8細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量-時間依賴效應關系（均P < 0.05）；50 μmol/L山姜素處理組腫瘤微球直徑較DMSO組明顯減小（P < 0.05），而100 μmol/L山姜素組劃痕寬度明顯寬于DMSO對照組（P < 0.05）；此外，50、100和200 μmol/L山姜素處理組Bax、cleaved-caspase-3和-9的表達明顯增加，Bcl-2、p-STAT3、c-myc、survivin蛋白表達明顯減少，均呈一定的劑量依賴效應關系（均P < 0.05）。而STAT3蛋白水平無明顯變化（P > 0.05）。 結論 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞增殖和遷移具有抑制作用，且可能與STAT3信號通路抑制以及線粒體凋亡通路激活相關。

[關鍵詞] 山姜素；卵巢癌；增殖；遷移；微球；凋亡

[中圖分類號] R711.75 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0013-05

[Abstract] Objective To explore the effect of alpinetin on human ovarian cancer cell line OVCAR-8 and its mechanism. Methods OVCAR-8 cells were treated with different concentrations of alpinetin （25， 50， 100， 200 and 400 μmol/L， DMSO as control） for different hours （24， 48 and 72 h）， then cell viabilities were detected by CCK-8 assays. 3D spheroid assay was used to measure the spheroid formation capacity of OVCAR-8 cell after treated with 50 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 7 days. Besides， wound healing assay was used to measure the migration capacity of OVCAR-8 cell after treated with 100 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 24 h. In addition， Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 signaling related and apoptosis related proteins in OVCAR-8 cells after alpinetin treatments （50， 100 and 200 μmol/L， DMSO as control） for 48 h. Results 25-400 μmol/L alpinetin had remarkable inhibiting effects on OVCAR-8 cells and in a dose-and time-dependent manner（all P < 0.05）. After 7 days′ treatment， the diameter of spheroid in 50 μmol/L alpinetin group was significantly shorter than DMSO control group （P < 0.05）. Besides， the width of wound in 100 μmol/L alpinetin group was significantly longer than DMSO control group after treatment for 24 h （P < 0.05）. In addition， the protein levels of Bcl-2， p-STAT3， c-myc and survivin were decreased in 50， 100 and 200 μmol/L group of OVCAR-8 cells than DMSO control group after 48 exposure. On the contrary， the protein level of Bax， cleaved-caspase-3 and -9 was increased （all P < 0.05）， and there were no significantly changes in STAT3 levels （P > 0.05）. Conclusion Alpinetin can inhibit the proliferation and migration of OVCAR-8 cells，its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signaling pathway and the activation of mitochondrial apoptosis signaling.

[Key words] Alpinetin； Ovarian cancer； Proliferation； Migration； Spheroid； Apoptosis

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，也是女性癌癥相關死亡的第五大常見原因[1]。其治療主要是以鉑類藥物為核心的化學治療，近年來化療藥物耐藥成為卵巢癌復發和死亡率上升的重要因素，因此發現新的抗卵巢癌藥物一直以來都是卵巢癌研究的熱點之一。山姜素是提取自草豆蔻根莖或種子的一種天然類黃酮類物質。具有鎮痛、抗炎和抗氧化作用[2]。近年來，國外有研究者將山姜素運用于抗肺癌及消化道等腫瘤的研究中[3-7]，并證實其抗腫瘤作用，但其對卵巢癌細胞的作用及其機制尚不明確。因此，研究山姜素對人卵巢癌細胞的作用及其分子機制，對抗卵巢癌新藥發現具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備

山姜素（Alpinetin）購于成都曼斯特生物科技有限公司（A1051，HPLC純度≥98%）；RPMI1640培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS，20012027）、胎牛血清購于美國賽默飛世爾科技有限公司；RAPI裂解液（P0013B）、CCK-8試劑盒（C0038）和BCA試劑盒（P0012）購于碧云天生物技術有限公司；抗GAPDH（2188R）、β-actin（0061R）、STAT3（1141R）、p-STAT3（1658R）、c-myc（4963R）、Survivin（0615R）、Bcl-2（0032R）和Bax（20386R）一抗購自北京博奧森生物技術有限公司；抗cleaved-caspase-3（9664）和cleaved-caspase-9（20750）購自美國CST公司；羊抗兔熒光二抗（C40109-04）購于美國LI-COR公司；CO2培養箱為德國BINDER公司產品（BD53型）；倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品（CKX31型）；酶標儀為美國PerkinElmer公司產品（1420型）；電泳電轉儀為北京六一儀器廠產品（DYCZ-40D型）；雙色紅外激光成像系統為美國LI-COR公司產品（Odyssey）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人卵巢癌OVCAR-8細胞購于博奧派克生物有限公司（BI0-247），培養于RPMI1640培養基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細胞增殖活力檢測 OVCAR-8細胞以3×103細胞/孔接種于96孔板，24 h后更換含不同濃度山姜素的培養基100 μL。藥物濃度分別為25、50、100、200和400 μmol/L，以DMSO為溶劑對照組，分別于24、48、72 h更換CCK-8檢測試劑100 μL（90 μL RMPI1640培養基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃培養箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度值（A）。實驗重復3次。計算細胞增殖活力：細胞活力（%）=（實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 3D腫瘤微球形成實驗 OVCAR-8細胞以3×103細胞/孔接種于每孔含5 μL膠原蛋白的超低黏附96孔板，24 h后采用倒置顯微鏡拍照，拍照后加入山姜素（50 μmol/L），以DMSO為對照；7 d后再次拍照記錄，計算腫瘤微球直徑。

1.2.4 劃痕實驗 OVCAR-8細胞以2×105細胞/孔接種于六孔板，待細胞長至完全融合后采用200 μL槍頭在中央劃痕，PBS沖洗后采用倒置顯微鏡拍照；換液后用100 μmol/L處理24 h，以DMSO為對照，再次使用倒置顯微鏡拍照，計算劃痕寬度。

1.2.5 Western blot 以DMSO為對照，采用不同濃度（50、100和200 μmol/L）山姜素處理OVCAR-8細胞48 h，隨后使用RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）提取細胞蛋白，使用BCA法測定蛋白樣品濃度。以每孔30 μL蛋白體系，行10% SDS-PAGE凝膠電泳并電轉移至PVDF膜；3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜；洗膜后加入熒光山羊抗兔二抗室溫搖床孵育1 h；洗膜后于雙色紅外激光成像系統掃描收集熒光信號。以GAPDH或β-actin為內參照，采用QuantityOne-v4.6.2軟件對Western條帶進行定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet t法，組內兩兩比較采用Tukey法，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞增殖活力的作用

與DMSO對照組比較，采用25、50、100、200和400 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細胞24、48和72 h后，細胞活力明顯下降，增殖受到明顯抑制，且呈劑量-時間依賴效應關系，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞腫瘤微球形成的影響

與DMSO對照組比較，50 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細胞7 d后，腫瘤微球直徑明顯減小，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞遷移的影響

100 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細胞24 h后，劃痕寬度明顯大于DMSO對照組，細胞遷移能力明顯受到抑制，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞STAT3信號通路的影響

與DMSO對照組比較，各處理組STAT3蛋白水平無明顯變化（P > 0.05），而50、100、200 μmol/L山姜素作用48 h后，p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達明顯減少（P < 0.05）。此外，與50 μmol/L組比較，100 μmol/L組細胞p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達明顯減少（P < 0.05），同時，與100 μmol/L組比較，200 μmol/L組細胞p-STAT3和c-myc蛋白表達下調（P < 0.05），Survivin蛋白水平差異無統計學意義（P > 0.05）。因此，山姜素能下調p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達，且呈現一定的劑量依賴效應關系。見圖4。

2.5 山姜素對山姜素對卵巢癌OVCAR-8細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與DMSO對照組比較，50 μmol/L山姜素作用48 h后，Bcl-2蛋白水平明顯減少、Bax和cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05），而cleaved-caspase-3蛋白水平差異無統計學意義（P > 0.05）。此外，與50 μmol/L組比較，100 μmol/L組細胞Bcl-2蛋白水平明顯減少，Bax和cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05）。同時，與100 μmol/L組比較，200 μmol/L組細胞cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05），Bcl-2和Bax蛋白水平差異無統計學意義（P > 0.05）。因此，山姜素能下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增加促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平，且呈現一定的劑量依賴效應關系。見圖5。

3 討論

卵巢癌因其發現是多為晚期，是女性死亡率最高的生殖道惡性腫瘤，嚴重威脅女性的健康[1]。山姜素是提取自草豆蔻根莖或種子的一種天然類黃酮類物質，研究表明山姜素對于多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用[2-7]。本實驗用山姜素體外實驗研究觀察其對卵巢癌OVCAR-8細胞的增殖和遷移抑制作用，結果提示山姜素具有抗卵巢癌治療潛能。

首先，CCK-8細胞活力檢測結果提示，山姜素在25～400 μmol/L濃度范圍內對OVCAR-8細胞的增殖活力均有抑制作用，并呈現明顯的劑量和時間依賴效應關系。此外本研究還通過3D腫瘤微球形成實驗進一步證實了山姜素對OVCAR-8細胞的增殖活力的抑制作用。除了快速增殖的特性，侵襲遷移也是卵巢癌的惡性習性之一，因此本研究還通過劃痕實驗來檢測山姜素對卵巢癌細胞侵襲遷移能力的作用，結果提示，山姜素可明顯抑制OVCAR-8細胞的遷移能力。

線粒體凋亡途徑是腫瘤細胞凋亡的重要機制之一，Bcl-2家族成員在腫瘤細胞凋亡中也發揮重要作用。Bax轉位入核促進Caspase-9活化進而剪切激活下游的caspase-3，從而導致細胞凋亡，而Bcl-2可抑制Bax的作用[8-14]。本研究發現不同濃度山姜素處理組OVCAR-8細胞后促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3和-9表達明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下調，且呈現一定的劑量依賴效應。此外，在肺癌和消化道腫瘤的相關研究中也證實山姜素可促進促凋亡蛋白Bax的表達、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達[3]，提示山姜素可通過增加Bax/Bcl-2比例，激活以線粒體為中心的信號轉導途徑而誘導卵巢癌細胞凋亡。

STAT3信號通路腫瘤相關的重要信號通路。磷酸化活化的STAT3轉位入細胞核，進而促進包括c-myc、cyclin-D1、Mcl-1、survivin等在內的一系列基因的表達，從而參與卵巢癌發生、增殖、侵襲、耐藥和復發[15-20]。本研究為了研究STAT3信號通路在山姜素誘導卵巢癌OVCAR-8細胞增殖和遷移抑制中的作用，結果提示，山姜素可通過抑制STAT3信號通路進而發揮抗卵巢癌作用。此外，肺癌與消化道腫瘤的相關研究表明，PI3K/Akt和Notch信號通路也參與山姜素的抗腫瘤作用[3，6]，因此，我們猜測山姜素可通過對多條信號通路的調控從而發揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，山姜素是一種具有潛在抗人卵巢癌作用的中藥活性成分，可通過抑制STAT3信號通路來抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移，并通過線粒體凋亡途徑促進卵巢癌細胞的凋亡，為抗卵巢癌新藥的研發開辟了新的領域。

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