血清標本保存條件及反復凍融對胃蛋白酶原檢測結果影響

余國慶 孫紅 周麗玲 余南俊 趙越

【摘要】 目的：分析血清樣本保存溫度、保存時間及反復凍融對胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）檢測結果的影響。方法：收集體檢血清樣本40份，使用全自動生化儀采用膠乳增加免疫比濁法定量檢測血清中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的濃度作為第0天或者第0次的結果。將每份標本分成16份，每5份為一組，分別置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃環境保存，分別在保存后的1、3、6、10、15 d取出檢測血清PGⅠ、PGⅡ濃度；另外1管置于-20 ℃冰箱凍存，2～3 h后再解凍進行PGⅠ、PGⅡ檢測，測完成后立即于-20 ℃進行凍存，如此反復凍存6次，將25 ℃、4 ℃、-20 ℃不同保存天數及反復凍融PGⅠ、PGⅡ濃度檢測結果與對照組結果進行比較。結果：血清PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃條件下保存3 d濃度未發生顯著變化；PGⅡ在25 ℃、4 ℃保存條件下穩定3 d，在-20 ℃條件下保存6 d濃度無顯著降低。血清PGⅠ在第2次凍融后濃度顯著降低，PGⅡ濃度在第3次凍融后顯著下降。結論：PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃條件下均能保存3 d，PGⅡ在-20 ℃保存較25 ℃、4 ℃保存時間長，PGⅠ、PGⅡ冷凍保存需避免反復凍融。

【關鍵詞】 胃蛋白酶原Ⅰ； 胃蛋白酶原Ⅱ； 標本保存

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.034 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）07-0073-03

胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是胃液中胃黏膜分泌的無活性胃蛋白酶前體，根據其免疫原性、生化性質及組織細胞來源及分布可分為胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ），PG在胃中可以輔助消化食物，約有1%進入到血液中[1-2]。血液中PGⅠ、PGⅡ濃度及PGⅠ/PGⅡ比值在診斷慢性萎縮性胃炎有較高的特異性和敏感性，而慢性萎縮性胃炎是胃癌的主要癌前病變[3]。研究發現PG與胃癌關系密切，已作為胃癌早期篩查的一個重要指標，日本學者已將PGⅠ<70 g/L，PGⅠ/PGⅡ比值<3.0作為胃癌篩查的截斷值[4]。目前，臨床上檢測PGⅠ、PGⅡ的方法較多，有ELISA雙抗夾心法、免疫比濁法、化學發光法，但有關PGⅠ、PGⅡ血清樣本保存溫度、保存時間及反復凍融對檢測結果的影響報道并不多見。本研究主要分析PGⅠ、PGⅡ的血清樣本保存條件，為分析質量檢驗控制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取到筆者所在醫院體檢者40例，其中男38例、女2例，年齡22～55歲，平均（34.2±8.37）歲。所有入選者均被告知抽取血標本用于胃蛋白酶原保存條件研究，且研究并經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

所選體檢對象均于清晨空腹抽靜脈血進行檢測，每位體檢者使用普通真空管抽取2管血，每管5 ml，3 000 r/min離心10 min，制備血清（共3.75 ml），立即采用膠乳增加免疫比濁法（采用日立7180全自動生化分析儀）定量檢測血清中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的濃度作為第0天或第0次的結果，隨后分離血清進行分裝，每個體檢標本分裝為16份，其中15份每份150μl，每5份分為一組，分別放置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃條件下保存，并于放置后的1、3、6、10、15 d檢測PGⅠ、PGⅡ；另一份血清為1.5 ml，置于-20 ℃冰箱凍存，2～3 h后再解凍進行PGⅠ、PGⅡ檢測，測完成后立即于-20 ℃進行凍存，如此反復凍存6次。將25 ℃、4 ℃、-20 ℃不同保存天數及反復凍融后PGⅠ、PGⅡ濃度檢測結果與第0天或第0次的結果進行比較，同時計算相對于第0天或第0次結果的變化率，變化率=（第n天-第0天）/第0天×100%，或者變化率=（第n次-第0次）/第0次×100%。PGⅠ、PGⅡ試劑及校準品均由寧波美康生物科技有限公司提供。所有數據檢測均遵照本科室SOP文件操作規程，質控在控制范圍內，依正常流程送檢。

1.3 統計學處理

本研究數據采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析和處理，符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，采用配對t檢驗，不符合正態分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同溫度不同保存時間血清PGⅠ濃度結果

PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃均能穩定3 d，保存第6天的濃度均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），隨保存時間延長PGⅠ濃度下降，PGⅠ濃度下降率增大，6 d后，標本-20 ℃保存時PGⅠ濃度下降小于25 ℃及4 ℃保存條件，C差異均有統計學意義（P<0.05），見表1、表2。

2.2 不同溫度不同保存時間血清PGⅡ濃度結果

PGⅡ在25 ℃、4 ℃保存條件下穩定3 d，在-20 ℃保存條件下穩定6 d。超出穩定天數，PGⅡ濃度隨時間延長而下降，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。在-20 ℃條件保存PGⅡ血清標本6～15 d，其PGⅡ下降率低于25 ℃及4 ℃保存，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

2.3 反復凍融對血清PGⅠ、PGⅡ濃度影響

血清PGⅠ在第2次凍融后濃度顯著降低，PGⅡ濃度在第3次凍融后顯著下降，且PGⅡ濃度變化率受反復凍融降低程度低于PGⅠ，差異均有統計學意義（P<0.05）見表5、表6。

3 討論

血清胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值應用于慢性萎縮性胃炎的診斷已有數十年的歷史。相關報道指出，低水平的胃蛋白酶原Ⅰ及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值與慢性萎縮性胃炎密切相關，并且胃蛋白酶原Ⅰ及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值能夠預測胃癌的風險[5]。血清胃蛋白酶原Ⅰ水平和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值聯合應用可能有助于胃癌的早期診斷[6-7]。文獻[8]報道，早期和晚期胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值較正常人群水平顯著降低，而胃和十二指腸潰瘍的患者胃蛋白酶原Ⅰ水平顯著升高，與萎縮性胃炎患者相比，早期和晚期胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值水平更低；當以胃蛋白酶原Ⅰ 70 μg/L和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值6作為截斷水平診斷胃癌的敏感性和特異性分別是62.1%和94.2%。胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ、胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值有助于慢性萎縮性胃炎及胃癌早期診斷，但國外文獻[9]報道稱，檢測方法不同試劑廠商不同會導致胃癌風險分級的不一致。同樣，不同的保存條件和標本的轉運條件等分析前因素也可能對胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ檢測結果造成影響。

目前約70%檢驗誤差來自分析前檢驗標本的質量影響產生的誤差，檢驗標本質量好壞也是影響檢驗結果最大的不確定因素[10-11]。本研究結果顯示，不同溫度及不同保存時間血清胃蛋白酶原Ⅰ濃度均能穩定3 d，由于本試驗設計未進行連續每天檢測，故只能發現第6天PGⅠ濃度變化顯著，但胃蛋白酶原Ⅰ濃度下降幅度小，三種溫度均不到2%，15 d內變化幅度小于5%。PGⅡ濃度在3 d內不同溫度保存均很穩定，隨著時間延長降解幅度變大。可能與保存時間不斷延長，血清標本中的胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ抗原效價降低有關，本研究采用分離血清檢測胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ濃度，不受標本血細胞破碎溶血等因素影響，避免了對抗原抗體反映的非特異性吸附，可能這也是胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ濃度下降，但下降幅度較小的原因[12]。另外胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ在-20 ℃條件保存濃度沒有25 ℃、4 ℃保存下降明顯，可能是低溫降低了細菌繁殖代謝的速度，因而增加長期穩定性。

本文除研究保存時間及溫度對血清標本中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ濃度影響外，還對標本進行反復凍融，研究發現凍融第2次后胃蛋白酶原Ⅰ濃度即顯著改變，凍融6次后濃度變化率為-11.04（-12.22，-9.76）%；而胃蛋白酶原Ⅱ凍融3次后濃度才顯著降低，且凍融6次后濃度變化率為-2.55（-3.40，-1.53）%。說明反復凍融對胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ濃度均有影響，但對胃蛋白酶原Ⅰ濃度影響更明顯?？赡芊磸蛢鋈诟讓е挛傅鞍酌冈窨乖钚越档突蛘叩鞍踪|結構破壞，最終導致檢測濃度的下降。

綜上所述，血清胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ檢測宜盡快檢測，需要更長時間保存應最好存放在-20 ℃條件下。另外，凍存標本應盡量避免反復凍融后檢測，以免造成胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ濃度降低。

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（收稿日期：2017-09-12）