牡荊素對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響

蒙傳任，林稚鳳，邢紅宇

（1.海南省海口市第四人民醫院 檢驗科，海南 海口 571100；2.海南省中醫院 檢驗科，海南 海口 570311）

細菌能黏附于物體表面，并分泌細胞外基質將自身包裹，形成生物膜。生物膜狀態下的細菌具有更強的生存能力，能抵抗環境中的各種不利因素[1]。此外，生物膜還能抑制抗生素的滲透作用，極大的增加了細菌的耐藥性[2]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）被認為是能導致人體生物膜相關感染的最具危害性的病原菌，常導致一系列疾病，如：尿路感染、腎臟感染和肺囊性纖維化等[3]。近年來，隨著P.aeruginosa耐藥性的增高，傳統抗生素往往難以根除已形成的生物膜，因此，從自然界中發掘新的抗菌藥物已成為當前研究的熱點。

牡荊素（Vitexin,Vite）是一種分離自牡荊屬植物的一種多酚類化合物，具有一定的抑制細菌生物膜形成的能力。然而，單獨使用Vite并不能達到最佳抗生物膜效果[4]。因此，本研究詣在探討Vite與傳統抗生素聯合使用對P.aeruginosa生物膜的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與培養條件P.aeruginosa標準菌株PAO1購買自美國ATCC標準菌株保存庫，于-80℃冰箱保存，使用前室溫解凍，并在血瓊脂平板培養基上劃線接種，過夜培養后調取單個菌落劃線接種傳2代以獲得相對穩定狀態的菌株。

1.1.2 主要試劑與設備 TSB肉湯和Muller-HintonⅡ（MH Ⅱ）肉湯均購自美國BD公司，Vite、頭孢他啶（CAZ）、環丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（OFLX）和慶大霉素（GEN）均購自美國Sigma公司，結晶紫顆粒購自天津市化學試劑一廠，96孔無菌細胞培養板和多功能酶標儀等設備均由海南省海口市第四人民醫院檢驗科提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感實驗 用MH Ⅱ肉湯倍比稀釋各抗生素儲備液后分別加入100 μl至96孔板中的各孔，作為實驗組，同時分別設置陰性對照組（未加抗生素僅加培養基和細菌）和對照組（僅加培養基）。挑取血瓊脂平板培養基上過夜培養的單個菌落，用生理鹽水調為0.5麥氏濁度，再用MH Ⅱ肉湯按1∶20進行稀釋，分別向加了抗生素的各孔中加入10 μl已稀釋好的菌懸液，使最終實驗菌濃度約為5×105CFU/ml。置于恒溫培養箱中37℃孵育16 h，讀取結果。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）終點即為肉眼所見能完全抑制細菌生長的抗菌藥物的最高稀釋度[5]。

1.2.2 浮游菌生長曲線的繪制 PAO1于血瓊脂平板過夜培養后，調取單個菌落，用生理鹽水調節濃度至0.5麥氏濁度，3組分別加入系列已配備好的用LB肉湯稀釋的Vite溶液中（62.5、125.0、250.0 μg/ml），于37℃恒溫搖床180 r/min搖菌培養，每隔8 h，各吸取200 μl菌懸液于96孔板中，測量600 nm處的吸光密度值，連續監測24 h，繪制時間-生長曲線。

1.2.3 生物膜形成抑制實驗 用LB肉湯倍比稀釋Vite母液至實驗濃度（1 000.00～15.63 μg/ml），分別加入198 μl至96孔板中的各孔，備用。PAO1于血瓊脂平板培養基過夜培養后，調取單個菌落于裝有LB肉湯的離心管中過夜搖菌培養，用生理鹽水將菌懸液濃度調為約1麥氏濁度。再分別加2 μl菌懸液于備用的96孔板中，37℃恒溫培養箱中靜置孵育24 h后，棄去浮游菌，用生理鹽水輕洗2遍，再分別加入200 μl 0.1%結晶紫溶液染色15 min，棄去未與板壁細菌結合的結晶紫溶液，并用生理鹽水輕洗3遍后，分別加入200 μl無水乙醇，以溶解與細菌結合的結晶紫，并于570 nm處進行比色[6]。

1.2.4 Vite與抗生素聯用對生物膜的影響 用LB肉湯分別稀釋Vite和各抗生素母液至實驗濃度，使Vite與抗生素混合后Vite的終濃度為31.25 μg/ml，而CIP、GEN、CAZ和OFLX的終濃度分別為0.25、0.50、0.25和1.00 μg/ml。其余部分同上。

1.3 統計學方法

數據分析采用GraphePad Prism 6.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組獨立樣本的差異采用兩獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用方差分析，若方差齊則兩兩間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Vite對PAO1浮游菌生長的影響

不同濃度Vite與陰性對照組比較，250.0 μg/ml的Vite能部分抑制PAO1浮游菌的生長，差異有統計學意義（F=168.800，P=0.000）。實驗組Vite作用16和24 h可分別使細菌的生長量（OD600nm）從（0.35±0.01）和（0.49±0.02）減少到（0.17±0.03）和（0.26±0.03），差異有統計學意義（q=3.160和3.110，均P=0.000）。而當Vite的濃度≤125.0 μg/ml時，對實驗組PAO1的生長無影響，差異無統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 Vite抑制PAO1生物膜的形成

圖1 Vite對PAO1浮游菌生長的影響

當Vite的濃度為31.25 μg/ml，能使實驗組PAO1生物膜的形成量從100%減少到（80.00±4.62）%，差異有統計學意義（t=4.428，P=0.002）。且隨著Vite的濃度增高，其抑制生物膜的能力不斷增強。當Vite的濃度上升至1 000 μg/ml時，幾乎能完全抑制實驗組PAO1生物膜的形成。而Vite的濃度≤125.0 μg/ml時，對實驗組PAO1浮游菌的生長并無影響（見圖1），因此，Vite抑制PAO1生物膜形成的作用并非完全由其抑制浮游菌生長所導致。見圖2。

2.3 Vite與抗生素協同抑制PAO1生物膜的形成

圖2 Vite對PAO1生物膜的抑制作用

CAZ、CIP、GEN和OFLX的MIC值分別為0.5、0.5、2.0和8.0 μg/ml。對照組、CAZ組、Vite組、CAZ+Vite組的生物膜總量分別為（100.0±0.0）%、（99.9±3.3）%、（82.0±3.2）%、（39.4±5.3）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=199.00，P=0.000）；對照組、CIP組[（97.4±4.3）%]、Vite組、CIP+Vite組[（40.3±3.1）%]比較，差異有統計學意義（F=237.4，P=0.000）；對照組、GEN 組 [（98.9±3.9）%]、Vite組、GEN+Vite組[（23.3±4.1）%]比較，差異有統計學意義（F=422.70，P=0.000）；對照組、OFLX 組 [（87.3±5.2）%]、Vite 組、OFLX+Vite組[（50.2±3.1）%]比較，差異有統計學意義（F=61.04，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，Vite組較對照組降低（P＜0.05）；各聯合組較對照組和Vite組降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Vite與抗生素聯用對PAO1生物膜形成的影響

3 討論

近年來，細菌生物膜的感染率不斷增加，隨著而來的高耐藥率給臨床診療帶來極大的不便。傳統的抗生素往往難以完全根除體內的生物膜，而傳統抗生素與新型抗生物膜藥物聯合應用已成為目前研究的熱點。本研究通過96孔板結合結晶紫染色法半定量分析，探討Vite的抑制標準菌株PAO1生物膜的能力，并進一步探討其與抗生素CAZ、GEN、CIP和OFLX的聯合應用效果。本研究發現，當Vite濃度≥31.25μg/ml時能抑制PAO1生物膜的形成，且隨著濃度增高，抑膜能力增強，有明顯的劑量依賴性。且當Vite與抗生素聯用時，有明顯的協同抑制PAO1生物膜形成的作用。Vite是一種提取自牡荊屬的多酚類化合物。有研究表明，Vite還具有抵抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的作用[7]。然而，其具體機制還未明確。多酚類化合物具有細菌群體密度感應（quorum sensing,QS）系統抑制劑的作用。QS系統是細菌間進行交流的信號系統，調控著生物膜的形成和分散。P.aeruginosa的QS主要包括2大系統，即：Las系統和Rhl系統。Las系統主要包括LasI/R雙組份系統，Rhl系統主要包括LasI/R系統。細菌相互聚集時，自身能分泌一些信號分子，當這些信號分子濃度升高達到一定的閾值時，能與Las和Rhl系統的相應受體結合，通過信號傳導，調控下游生物膜相關基因的表達或抑制，進而對生物膜的形成進行調控[8]。多酚類化合物可對QS系統進行干擾，抑制QS系統的正常調控功能[9]，從而抑制生物膜相關基因表達而抑制生物膜的形成。生物膜的形成主要還受到第二信使環鳥苷二磷酸（c-di-GMP）的調控。高濃度的c-di-GMP能促進細菌黏附因子的表達，從而促進菌體的附著與生物膜的形成。而低濃度的c-di-GMP可以增強菌體的運動能力及毒素的表達，而抑制生物膜的形成[10]。因此，Vite的作用機制有可能是通過抑制細菌體內c-di-GMP的形成而發揮作用。

不合理使用抗生素，常使體內殘存亞抑菌濃度劑量的藥物。這種亞抑菌濃度的抗生素長期存在時，不但不能有效殺滅細菌，反而還能促進細菌的突變和耐藥性的增加。而生物膜的耐藥性比相應的浮游菌要大，單一的抗生素使用往往難以根除生物膜。而Vite特有的抑制生物膜形成的作用使其與抗生素聯用時有協同抑制生物膜形成的作用，從而可以一定程度上抑制亞抑菌濃度抗生素帶來的副作用。

總而言之，Vite能抑制P.aeruginosa生物膜的形成，且當其與抗生素CIP、CAZ、GEN和OFLX聯用使有協同作用。有望成為臨床治療細菌生物膜的一線用藥。

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