NOS1AP基因rs12742393位點多態性對瑞格列奈治療我國漢族2型糖尿病患者療效的影響Δ

王濤，魯茜，高杏，李偉，呂冬梅#（.徐州醫科大學附屬醫院藥學部，江蘇徐州00；.江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇徐州 004；.徐州醫科大學附屬醫院內分泌科，江蘇徐州00）

隨著人們生活方式的轉變，2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發病率迅速上升，已成為重要的公眾健康問題[1]。T2DM的發病機制尚未完全明確，但學者普遍認為是環境與易感基因相互作用的結果[2]。飲食控制和運動雖有助于維持T2DM患者的血糖水平，但T2DM患者最終仍需接受藥物治療[3]。瑞格列奈是一種廣泛用于治療T2DM的口服降糖藥物，其作用于胰島B細胞，調節腺苷三磷酸（ATP）敏感的鉀離子通道，影響鈣離子內流，快速促進餐后胰島素的釋放[4]。近年來研究發現，瑞格列奈單藥治療T2DM的療效及相關不良反應存在較大的個體差異，且一定程度上與基因相關的藥物吸收、分布、代謝過程，作用靶點以及T2DM發病通路中相關基因的突變有關[5-6]，提示T2DM相關易感基因的多態性可能會影響瑞格列奈的療效。

一氧化氮合成酶1調節蛋白（NOS1AP）又稱為一氧化氮合酶羧基末端PDZ結合配體（CAPON），通過作用于神經一氧化氮合酶（nNOS）PDZ區來調節nNOS的活性[7]。nNOS可催化生成一氧化氮，后者在調節心血管功能和葡萄糖代謝中具有重要作用，且胰島B細胞的nNOS功能紊亂與胰島素作用及分泌密切相關[8]。NOS1AP基因多態性與T2DM易感性的相關性已被證實，其中以rs12742393位點多態性與T2DM的關聯性為最強[9]，但目前尚未見NOS1AP基因rs12742393位點多態性與瑞格列奈療效相關性的報道。故本研究以我國漢族T2DM患者為對象，初步探討了NOS1AP基因rs12742393位點多態性對瑞格列奈療效的影響，為以基因為導向的個體化藥物治療提供遺傳藥理學依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入標準：①符合世界衛生組織糖尿病分型診斷標準[10]；②淮海地區漢族居民；③年齡25～70歲，BMI 18.5～30.0 kg/m2；④無胰島素促泌劑使用史；⑤為細胞色素P450（CYP）2C8*3 139Arg和有機陰離子轉運體1B1（OATP1B1）521TT基因型。排除標準：①接受過胰島素治療的患者；②使用過CYP2C8、CYP3A4、OATP1B1酶激動劑或抑制劑（如克拉霉素、吉非貝齊、環孢霉素等）的患者；③妊娠期或哺乳期婦女；④患有嚴重疾病（如急性心肌梗死、腦血管意外、嚴懲創傷和肝腎疾病）的患者。脫落標準：①發生不良反應且不能耐受者；②依從性差者；③主動退出本研究者；④缺乏療效等相關臨床資料者；⑤失訪者。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核批準，所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書。

選取2015年8月-2017年3月于徐州醫科大學附屬醫院內分泌門診初次確診為T2DM且未接受過任何降糖治療的漢族患者100例，其中男性58例、女性42例，平均年齡為（47.84±12.15）歲，平均體質量指數（BMI）為（25.16±3.20）kg/m2。

1.2 治療方法

所有患者在常規降壓、調脂治療的基礎上，加用瑞格列奈片（德國Novo Nordisk A/S公司，注冊證號：H20130023，批號：06406340D，規格：1.0 mg）1.0 mg，tid，于餐前15 min口服。所有患者均連續治療至少8周，治療期間飲食、運動習慣保持不變。

1.3 基因型檢測與分析

采用樹脂型基因組DNA提純試劑盒（上海賽百盛基因技術有限公司）從患者外周血白細胞中提取DNA。采用聚合酶鏈反應-限制性片斷長度多態性法（PCRRFLP）、使用Applied Biosystems 2720型PCR儀（美國Thermal Cycler公司）檢測患者NOS1AP基因rs12742393位點的基因型。PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司設計合成（上游引物：5′-GGTGAATGTGTACAAAGGAGAAGG-3′，下游引物：5′-CAAACTGAAATGGACCACAAAGAG-3′）。PCR反應體系（25 μL）包括DNA模板2.5 μL，10×Buffer 2.0 μL（含MgCl210 mmol/L），dNTP 1.0 μL（10 mmol/L），上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），Easy Taq DNA聚合酶0.25 μL（5 U/μL），滅菌雙蒸水18.25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環；72℃再延伸8 min。擴增產物經BsrⅠ酶酶切，酶切反應體系（20 μL）包括BsrⅠ內切酶0.5 μL（10 U/μL）、Buffer 2.0 μL、PCR 產物 10.0 μL、滅菌雙蒸水 7.5 μL。于65℃下消化4 h后，酶切產物經2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，使用Tanon-1600R型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）對電泳結果進行分析。

1.4 觀察指標

檢測患者的糖脂代謝和胰島素相關指標。①采用葡萄糖氧化酶法以Cobas 8000型全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）測定空腹血糖（FPG）和餐后血糖（PPG）水平；采用離子交換高效液相色譜法以HLC-723 G8型全自動糖化血紅蛋白分析儀（日本東曹株式會社）測定糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。②采用電化學發光法以Cobas 6000型全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）測定血漿胰島素[空腹胰島素（FINS）、餐后胰島素（PINS）]水平；采用穩態模式評估法[11]計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR（mU·mmol/L2）＝FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。③采用比色法以Microlab 300型半自動生化分析儀（荷蘭威圖科學公司）測定血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率表示，組間比較及基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡均采用χ2檢驗。正態性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫落情況

100例T2DM患者中有1例主動退出、1例失訪，共有98例完成了本研究。

2.2 NOS1AP基因rs12742393位點的基因型檢測結果及分布頻率

按“1.3”項下條件進行PCR擴增后，得長度為358 bp的擴增產物。該產物經BsrⅠ酶酶切后，共檢出AA（野生）型、AC（雜合子）型、CC（突變純合子）型3種基因型，其中AA型表現為152、206 bp 2個條帶，AC型表現為152、206、358 bp 3個條帶，CC型表現為358 bp 1個條帶，詳見圖1。98例患者中，AA、AC、CC型患者各39、42、17例，分布頻率分別為39.8%、42.9%、17.3%；A、C等位基因分布頻率分別為61.2%和38.8%。各基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

圖1 NOS1AP基因擴增產物經酶切后的電泳圖Fig 1 Electrophorogram of amplified products of 斜體>NOS1AP gene after enzyme digestion

2.3 治療前后T2DM患者各項臨床指標比較

98例T2DM患者接受瑞格列奈連續治療8周后，其FPG、PPG、HbA1c、HOMA-IR、TC、TG水平較治療前均顯著下降，FINS、PINS水平較治療前均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而治療前后患者HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 98例T2DM患者治療前后各項臨床指標比較（n＝98）Tab 1Comparison of clinical indexes in 98 patients with T2DM before and after treatment（n＝98）

2.4 NOS1AP基因rs12742393位點多態性對瑞格列奈療效的影響

3種基因型患者的性別、年齡、BMI、腰臀比等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療前，AA、AC、CC型患者各項臨床指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，各基因型患者FPG、PPG、HbA1c水平，AA型患者HOMA-IR水平，CC型患者TC水平，AA、CC型患者TG水平均較治療前顯著下降；各基因型患者PINS水平，AC、CC型患者FINS水平，CC型患者HOMA-IR水平均較治療前顯著升高；CC型患者FPG、PPG水平顯著高于AA、AC型患者，其較治療前的下降值顯著小于AA、AC型患者；AC型患者FPG水平顯著高于AA型；AC、CC型患者FINS水平及較治療前的上升值、HOMA-IR水平均顯著高于或大于AA型，各基因型患者HOMA-IR較治療前的變化值兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而其余指標在治療前后、組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2～表4。

表2 各基因型T2DM患者治療前后血糖水平比較（±s）Tab 2 Comparison of blood glucose levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment（±s）

表2 各基因型T2DM患者治療前后血糖水平比較（±s）Tab 2 Comparison of blood glucose levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment（±s）

注：與治療前比較，＊P＜0.05；與AA型比較，#P＜0.05；與AC型比較，ΔP＜0.05Note：vs.before treatment，＊P＜0.05；vs.AAgenotype，#P＜0.05；vs.AC genotype，ΔP＜0.05

HbA1c，%FPG，mmol/L基因型n PPG，mmol/L差值-2.71±1.49-2.48±1.31-2.51±2.03 0.251 0.778 AA型AC型CC型F/H P 39 42 17治療前9.99±2.39 10.45±2.22 10.10±2.01 0.986 0.611治療后6.50±1.27＊7.30±1.50＊#9.09±2.05＊#Δ 29.056＜0.001差值-3.49±2.37-3.15±2.23-1.01±0.85#Δ 20.313＜0.001治療前17.24±4.03 17.23±3.59 17.04±4.58 0.373 0.830治療后10.45±3.23＊11.34±2.85＊13.61±3.92＊#Δ 5.446 0.006差值-6.80±4.10-5.89±3.61-3.44±2.80#Δ 11.352 0.003治療前9.72±1.79 9.55±1.78 9.35±2.27 1.435 0.488治療后7.01±0.74＊7.07±1.01＊6.85±0.61＊0.432 0.650

表3 各基因型T2DM患者治療前后胰島素水平比較[M（P25，P75）]Tab 3 Comparison of insulin levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment[M（P25，P75）]

表4 各基因型T2DM患者治療前后血脂水平比較Tab 4 Comparison of blood lipid levels among T2DM patients with different genotypes before and after treatment

3 討論

NOS1AP基因位于染色體1q23.3，長度約299 kb，編碼NOS1AP蛋白，后者與線粒體和細胞質中的nNOS結合，nNOS通過抑制鈣離子內流來調節細胞內鈣離子濃度和胰島素釋放[8-9]。有研究指出，中樞神經系統的一氧化氮合酶（NOS）受到抑制后，可造成胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，從而引發高血糖[8]。Hu C等[9]以我國漢族人群為研究對象，發現其NOS1AP基因rs12742393位點多態性與T2DM易感性最為相關，該位點位于NOS1AP基因內含子2區域，突變類型為A/C，風險基因為C。現有文獻以NOS1AP基因rs12742393位點多態性與精神分裂癥的相關性研究居多，其機制可能與該位點突變后影響轉錄因子結合和NOS1AP基因表達相關[12]。有研究顯示，NOS1AP基因突變可影響磺脲類和格列奈類藥物的療效[9]。一項以上海市漢族人群為對象的研究發現，NOS1AP基因rs10494366位點堿基突變可影響瑞格列奈的療效，其中NOS1AP基因rs10494366位點TG和GG型患者的病死率更低[13-14]。然而，另一項以韓國人群為對象的研究結果則顯示，NOS1AP基因rs10494366位點多態性與格列美脲的療效無關[15]。目前雖未見NOS1AP基因rs12742393位點多態性對瑞格列奈療效影響的相關報道，但NOS1AP基因rs12742393位點多態性可直接或間接影響胰島B細胞功能或胰島素分泌[8]，而瑞格列奈可促進胰島B細胞釋放胰島素，故探討NOS1AP基因rs12742393位點多態性與瑞格列奈療效的相關性具有一定的臨床意義。

瑞格列奈在體內經過OATP1B1轉運至肝細胞，通過肝臟CYP2C8和CYP3A4酶代謝為無活性的產物[16-17]。因此，OATP1B1、CYP3A4、CYP2C8基因突變可能會影響瑞格列奈的體內代謝過程[17-18]。其中，OATP1B1 521T＞C位點的突變可抑制OATP1B1的轉運活性，從而導致瑞格列奈血藥濃度的升高[18]；CYP2C8*3多態性可影響瑞格列奈的藥動學和藥效學特征[17]。因此，本研究選擇了具有相同OATP1B1、CYP2C8*3基因型（野生型）的患者作為研究對象，以排除相關基因多態性對藥物代謝的影響。由于CYP3A4存在多個突變位點，其中大部分位點在我國漢族人群中的突變頻率較低[19]，故本研究暫未考慮CYP3A4基因多態性的影響。

本研究結果顯示，治療后各基因型患者FPG、PPG、HbA1c水平，CC型患者TC水平，AA、CC型患者TG水平均較治療前顯著下降；各基因型患者PINS水平，AC、CC型患者FINS水平均較治療前顯著升高；CC型患者FPG、PPG水平顯著高于AA、AC型患者，其較治療前的下降值顯著小于AA、AC型患者；AC型患者FPG水平顯著高于AA型；AC、CC型患者FINS水平及較治療前的上升值均顯著高于或大于AA型，差異均有統計學意義。這提示經瑞格列奈治療后，攜帶風險基因C的T2DM患者的FPG、PPG和FINS水平顯著高于AA（野生）型患者，從一定程度上揭示了NOS1AP基因rs12742393位點多態性與瑞格列奈療效的相關性。此外，治療后CC型患者體內TC、TG水平也較治療前顯著下降，但各基因型患者之間血脂水平差異不大，提示NOS1AP基因rs12742393位點多態性可能與瑞格列奈的調脂作用無關。

患者體內長期的高血糖水平可加重胰島素抵抗，胰島B細胞會代償性分泌大量胰島素使血糖維持在正常范圍內，故臨床上常用HOMA-IR來評估T2DM患者的胰島素抵抗水平[11]。本研究結果顯示，AA型患者HOMA-IR水平較治療前顯著降低，CC型患者該指標則較治療前顯著升高，且AC、CC型患者該指標顯著高于AA型，各基因型患者HOMA-IR較治療前的變化值兩兩比較差異顯著，提示T2DM患者攜帶風險基因C越多，其HOMA-IR水平越高。其中，CC型患者胰島素抵抗水平最高，其胰島素敏感性明顯下降，需要釋放更多的胰島素來維持正常的血糖水平。有動物研究表明，敲除小鼠nNOS相關編碼基因可誘導其發生胰島素抵抗[20]；同時，胰島B細胞nNOS功能紊亂與胰島素抵抗及胰島素分泌有關[8，21-22]。由此推測，NOS1AP基因rs12742393位點風險基因C可影響瑞格列奈治療T2DM的療效，且可能與胰島素抵抗有關。

綜上所述，NOS1AP基因rs12742393位點多態性可影響瑞格列奈治療我國T2DM患者的療效，NOS1AP基因rs12742393位點風險基因C可通過影響患者FPG、PPG、FINS和HOMA-IR水平來降低瑞格列奈的療效。這一結論可為該藥的臨床應用提供一定的參考。但本研究尚存在以下不足之處：（1）僅研究了與T2DM相關性明顯的NOS1AP基因rs12742393位點，而其他與之處于連鎖不平衡中的重要單核苷酸多態性有可能被忽略；（2）考慮到患者的依從性及回訪率，入組患者連續接受瑞格列奈治療至少8周，雖在該時間段內可觀察到相關臨床指標的明顯變化，但觀察HbA1c下降最理想的時間是在治療后12周[23]；（3）樣本量不夠大，可能會造成一定偏倚。因此，本研究將繼續擴大樣本量，并進一步對基因多態性與藥物相互作用的機制進行研究，更深入地闡明降糖藥物療效的遺傳藥理學決定因素。

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