甘薯病毒病原相關的microRNA的挖掘及分析

李華偉，劉中華，張鴻，許泳清，李國良，林趙淼，邱永祥，羅文彬，紀榮昌，湯浩，邱思鑫

（福建省農業科學院作物研究所/農業部南方薯類科學觀測實驗站，福州350013）

0 引言

【研究意義】MicroRNA（miRNA）是一類內源性小分子非編碼的單鏈RNA，其長度范圍在19—25 nt。植物中的miRNA高度保守，在轉錄水平通過堿基互補配對的方式識別并調控靶基因的表達，進而參與植物抗逆性、生長發育、新陳代謝等生物學過程[1-2]。動植物中 miRNA表達受病毒感染調控，miRNA表達能夠引起靶基因及其后續信號途徑、代謝和免疫應答變化，引導細胞逃避或者抵抗病毒感染帶來的損傷[3-5]，另外，病毒感染可導致農作物產量和品質的下降[6-7]，因此，鑒定植物中由病毒感染引起的miRNA表達差異，能夠促進對植物抗病毒感染機制的深入了解。【前人研究進展】高通量測序技術的發展推動miRNA的挖掘分析，目前為止在植物中被鑒定出來miRNA已包含40多個miRNA家族。劉辛[8]報道了黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和番茄不孕病毒感染番茄植株后，對miRNA及其靶基因的表達有不同程度的影響；陳莎[9]采用深度測序方法挖掘并鑒定云南和貴州省玉米病毒的種類；王園龍等[10]利用高通量測序技術鑒定白花泡桐中與鹽脅迫相關的差異 miRNA，發現 33個已知miRNA和80個新的miRNA表達具有差異性；陳潔[11]利用Solexa深度測序分析獲得玉米根系中與重金屬Pb脅迫相關的92個已知的miRNA和378個新的miRNA及其靶基因；馬驄毓[12]運用高通量測序方法及生物信息學分析手段，鑒定出與馬鈴薯抗旱相關的89個已知miRNA和239個未知miRNA及其靶基因，因此，利用高通量測序是一種篩選與抗病毒相關miRNA的高效技術手段[13]?！颈狙芯壳腥朦c】甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯曲葉病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）等 10多種病毒是甘薯（Ipomoea batatas）中常見的感染病原[14]，這些病毒嚴重影響了甘薯的性狀、產量以及品質。但目前為止，尚未有關于甘薯病毒相關的miRNA鑒定和分析的報道。【擬解決的關鍵問題】通過比較被病毒感染的甘薯樣品之間的差異表達 miRNA，鑒定不同病毒感染引起的差異表達miRNA及其相關應答機制，明確與甘薯病毒感染相關的miRNA，為miRNA參與感染抗病毒脅迫的機制研究打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年4月至2017年10月在福建省農業科學院作物研究所薯類中心試驗室進行。

1.1 材料

甘薯品種龍薯9號材料均于2017年5月采自福建泉州地區，時間為植株自然發病。4個材料的病理癥狀包含了畸形黃化、皰疹、褪綠矮化、曲葉等癥狀（圖1）。試驗驗證時，采用脫毒苗作為無病毒對照樣本。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提、Illumina文庫構建及測序 于甘薯生長期采樣，每個癥狀的植株采樣3株，收集等量葉片后混合，采用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒（上海生工）抽提葉片 RNA?？?RNA的質量檢測由NanoDrop 2000超微量分光光度計（上海美普達儀器有限公司）和Agilent 2100生物分析儀（Agilent，美國）進行。miRNA測序文庫的構建按照Illumina公司TruSeqTMSmall RNA Sample Prep Kits（Illumina，美國）試劑盒提供的標準流程進行。采用Illumina Hiseq 2500平臺進行small RNA測序，讀長為單端1×50 bp。

1.2.2 數據質控及分析 獲得clean small RNA數據后，對其長度、種類及豐度分析，運用 Blast軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）與 Rfam11數據庫（http://Rfam.sanger.ac.uk/），過濾、剔除非small RNA序列（mRNA、rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等）。最后運用 Bowtie 軟件（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）分析small RNA序列在基因組上的分布情況。通過與甘薯病毒庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses）比對，鑒定測序數據中的與病毒種類。

1.2.3 已知miRNA的鑒定 將small RNA序列與甘薯參考基因組中 miRNA前體及成熟體序列進行比對，進行已知 miRNA的鑒定，運用 RNAfold軟件（http://www.tbi.univie.ac.at/RNA/）和 Mireap 軟件（http://mireap.sourceforge.net/）預測和分析 miRNA二級結構。

1.2.4 新miRNA的鑒定 將未注釋的small RNA序列數據運用Mireap軟件（http://mireap.sourceforge.net/）進行序列二級結構分析和新 miRNA的預測，新miRNA預測標準參考MEYERS等描述，參考預測結果結合Dicer酶切位點信息、能量值等特征預測、鑒定新miRNA[10,15]：1、miRNA前體具有標志性發夾結構；2、序列長度在18—32 nt；3、最低自由能（MFE）≤-75 kJ·mol-1，且對稱度為 7 nt，最長距離 100 nt，堿基配對數10 nt。

1.2.5 差異表達 miRNA鑒定及靶基因預測 根據每個 miRNA分別在樣本文庫中的相對表達豐度（TPTM），運用DEGseq和DEseq R語言包中Expdiff方法選擇差異表達 miRNA及其顯著性，差異表達miRNA的鑒定標準為│log2(TPTM1/TPTM2ratio)│≥1且P-value≤0.05。運用 TargetFinder對差異表達miRNA靶基因預測[16]。

1.2.6 差異表達miRNA靶基因GO和KEGG pathway富集分析 利用Goatools （https://github.com/tanghaibao/GOatools）軟件進行GO分析，將miRNA靶基因按照生物學過程、構成細胞的組分，實現的分子功能等進行分類，Fisher精確檢驗，多重檢驗方法（Bonferroni,Holm, Sidak和false discovery rate，BH（FDR））對P值進行校正，校正后P值（P-FDR/ correctedP-value）≤0.05視為顯著富集的 GO功能。采用 KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu. cn/home.do）進行差異表達miRNA靶基因KEGG pathway富集分析，滿足校正后P值（correctedP-value）≤0.05的KEGG通路視為顯著富集的KEGG通路。

1.2.7 差異表達 miRNA的實時熒光定量 PCR檢測

miRNA的相對表達量檢測采用stem-loop方法進行檢測，設計miRNA的stem-loop引物、miR通用反向引物、PCR的正向引物（表1），用TaKaRa公司的熒光定量PCR試劑盒進行檢測，使用ABI PRISM 7500實時熒光定量PCR系統進行擴增。擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃ 15 s，65℃ 45 s，40個循環，65℃保存。以actin作為內參，miRNA的相對表達量以 2-ΔΔCt公式進行計算。

1.2.8 半定量PCR及一代測序檢測 半定量PCR檢測病毒的表達，病毒相關序列及引物名稱如表1，擴增體系為20 μL（含10 μL擴增混合物），擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收陽性條帶后進行一代測序，對所得序列與NCBI數據庫進行比對分析。

2 結果

2.1 樣本癥狀、測序數據質控及比對分析

如圖1所示，4個樣本之間的癥狀各有不同，分別表現為典型的畸形黃化、皰疹、褪綠矮化以及曲葉癥狀。4個樣本所得測序數據clean reads Q20%值＞98%，Q30%值＞95%（表2）。對small RNA的長度分析顯示3個文庫中small RNA的長度在21、22和24 nt的豐度較高（圖2），而Fj01樣本的small RNA長度在18—21 nt間分布較多，各樣本之間small RNA的長度峰值稍有不同。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 The primers for real-time PCR

圖1 甘薯病毒感染后不同癥狀Fig. 1 Different symptoms after sweet potato virus infection

表2 Illumina測序數據統計表Table 2 Summary of the Illumina sequencing results

4個文庫數據中非small RNA序列占比在0.31%—1.32%，比對到參考基因組的比率為 70.59%—92.34%，表明本次測序所得的數據質量較高（表3）。

圖2 Small RNA的長度分布Fig. 2 Distribution of small RNA length

表3 Small RNA注釋及參考基因組比對率Table 3 Annotation of small RNA and mapped rate to reference genome

2.2 病毒庫比對結果分析

將所得的small RNA reads與甘薯病毒庫進行比對（BLASTn），4個樣本與病毒庫匹配度為0.0002%—0.0048%（附表1），除1H外，均感染多種甘薯病毒，包括甘薯常見病毒甘薯 G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）、甘薯病毒2號（Sweet potatovirus 2，SPV2）、甘薯C病毒、甘薯褪綠矮化病毒、甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）等。另外還有落葵皺紋花葉病毒（Basella rugose mosaic virus，BaRMV）、豇豆蚜傳花葉病毒（Cowpea aphid-borne mosaic virus，CAMV）、蔥花葉病毒（Scallion mosaic virus，ScaMV）、人參Y病毒（Panax virus Y，PanVY）等非甘薯常見病毒。

1H 樣本除西部云杉色卷蛾顆粒體病毒（ChocGV）、沙門達病毒N/NSs（SHAV-N/NSs）和腸桿菌噬菌體病毒（Enterobacteria phage virus）外并無其他病毒感染。而其他3個樣本之間的病毒感染相差不大，但種類特殊，如Fj02樣本（皰疹）特異性感染了山藥溫和花葉病毒（Yam mild mosaic virus，YMMV）、馬鈴薯潛隱病毒（Potato latent virus，PLV）等，而Fj03樣本中甘薯雙生病毒種類較多，如甘薯上海曲葉病毒（Sweet potato leaf curl Shanghai virus，SPLCShV）和甘薯孟加拉曲葉病毒（Sweet potato leaf curl Bengal virus，SPLCBeV）。

采用半定量PCR檢測了SPFMV和SPVC兩個病毒在癥狀樣本及無癥狀（脫毒苗，對照）樣本中表達情況，發現SPFMV和SPVC兩個病毒在對照樣本中無表達，在4個癥狀樣本中具有不同程度的表達（圖3），一代測序結果與 NCBI數據庫比對結果顯示，Fj01-03樣本中均檢測到了 SPFMV和 SPVC病毒序列，但1H樣本序列與NCBI數據庫不匹配，與二代測序結果基本一致。

圖3 PCR驗證甘薯病毒在樣本間的表達Fig. 3 Expression of sweet potato virus by PCR analysis

表4 樣本間的差異表達miRNATable 4 Differentially expressed miRNA between samples

2.3 已知miRNA和新miRNA的鑒定

通過與 miRBase20數據庫（http://www.mirbase.org/）中植物miRNA前體序列比對，共鑒定到679個已知miRNAs，其中包括常見的miRNA家族成員，如miR156、miR166、miR169等家族。另外運用Mireap軟件鑒定到1 004個新的miRNA。

2.4 差異表達miRNA篩選及其靶基因預測

通過對不同癥狀樣本數據的比較分析，共篩選到288個已知的差異miRNA和433個新的差異miRNA（圖4、表4）。這288已知差異miRNA包括miR156、miR157、miR166、miR172等家族的全部或者部分成員，并預測到417個靶基因；433個新的差異miRNA有1 856個靶基因。這些靶基因多為轉錄因子家族成員，其編碼蛋白多含有 ZFP、bHLH、SPL、lectin和homeobox-leucine zipper protein等功能區域。通過對已知的差異miRNA進行比較，發現miRNA家族部分或者全體均為差異 miRNA，如 miR156家族、miR157家族全體成員等在樣本之間表達均有差異，部分miRNA 的成員，如 miR166d/e/t，miR169i/o/u、miR395b/c/d等在不同癥狀樣本之間表達也具有差異，而且這些差異 miRNA在馬鈴薯、擬南芥、水稻、大豆、番茄中的保守性比較好。

通過 stem-loop PCR，檢測了已知差異 miRNA（miR-156和 miR-319m）和新的差異 miRNA（novel-miR-40）的表達，結果顯示這3個miRNA的表達模式與sRNA-seq分析結果相似（圖5），這表明測序數據真實度較高。

2.5 病毒相關miRNA的差異表達

圖4 差異表達miRNA的Venn圖Fig. 4 Venn graphics of differentially expressed miRNA

圖5 差異表達miRNA的PCR驗證與RNA-seq分析Fig. 5 Comparative analysis of the expression profiles of the differentially expressed miRNAs by PCR and RNA-seq

為了分析不同癥狀樣本之間的差異miRNA，對4個樣本進行配對比較分析，與1H樣本比較，Fj01、02和03樣本中的miR-156和miR-157表達量分別顯著下降，miR-156家族的成員miR-156a/d/e/g/o和miR-157家族成員miR-157c在Fj01、02和03樣本中的表達量均顯著高于 1H樣本，而 miR-156f/k和miR-157b/d/r的表達量在 1H樣本中顯著高于其他樣本，對Fj01、02和03這3個樣本之間兩兩比較發現，miR-156a/d/g/k在Fj01或Fj02中的表達量最高，Fj03中最低，miR-156e在Fj02中表達量最高，Fj01中次之，Fj03中最低，同樣miR-157家族成員在3個樣本中分別具有不同程度的上調或下調趨勢，表明病毒感染能夠引起 miR-156和 miR-157的差異表達。miR-159、miR-166、miR-167、miR-169、miR-319、miR-395、miR-396、miR-2630等家族的成員在4個樣本之間的表達量也存在顯著差異。

為了檢測 miRNA表達與病毒感染的相關性，運用實時定量 PCR方法檢測隨機選擇的 3個 miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4個癥狀樣本及對照（無病毒感染）樣本中的表達情況，結果表明，與對照樣本相比，這幾個miRNA在1H和Fj01-03幾個樣本中表達量有不同程度的上調（圖6），與上述分析結果基本一致，這表明病毒感染能夠引起miRNA的差異表達，但由于田間感染病毒類型的多樣性和癥狀的復雜性，病毒種類與差異 miRNA的相關性需要進一步的分析和驗證。

2.6 差異表達miRNA的GO和KEGG pathway富集分析

2.6.1 已知的差異miRNA靶基因富集分析 通過對差異表達 miRNA靶基因的 GO富集分析，已知的差異miRNA靶基因的富集到19個顯著富集的GO功能團（P-FDR≤0.05），表明這些差異miRNA的靶基因均與植物的生長發育、細胞分化、形態形成等相關（圖7）。

KEGG pathway富集結果顯示已知的差異miRNA靶基因沒有顯著富集的pathways（correctedP-value＜0.05）。因此僅對前10個pathways分析，發現已知的差異miRNA靶基因與植物“病原加工與呈遞”（ko04612）、“內質網蛋白加工”（ko04141）以及MAPK、mTOR等信號通路有關（附表2），如葉綠體熱激蛋白（chloroplast heat shock protein 70-2，cpHSP70-2）。

圖6 PCR驗證差異表達miRNA在癥狀樣本和對照之間的表達情況Fig. 6 The relative expression level of 3 miRNAs in sequenced data and control samples by PCR

圖7 已知差異表達miRNA靶基因的前30個GO富集分析結果Fig. 7 The top 30 GO enrichment of known differentially expressed miRNA targets

2.6.2 新的 miRNA靶基因富集分析 新的差異miRNA靶基因并沒有顯著富集的 GO和 KEGG pathway（correctedP-value＜0.05）。同樣，對前 10個相對比較顯著的pathway富集結果分析，發現新的miRNA靶基因與植物“植物病原菌互作”有關，包括novel-miR-808、838和1157的靶蛋白：鈣依賴性蛋白激酶或鈣結合蛋白（calcium-binding protein，CML22、CML31和 CML45）、novel-miR-300 靶蛋白NBS-NBS-LRR型抗病蛋白（NBS-NBS-LRR type disease resistance protein）等，這些靶蛋白通過直接或者間接的識別抗原，再通過不同的通路傳遞信號，參與植物的防御和抗病機制。

3 討論

本研究中采用Illumina的高通量測序技術對具有不同病毒感染癥狀的4個甘薯樣本的葉片（龍薯9號）進行 miRNA測序，從中篩選與病毒類型相關的差異miRNA。得到的數據與參考基因組比對率較高（70.59%—92.34%），不同樣本RNA的長度分布具有差異性，表明small RNA長度分布可能與病毒感染有關。

不同于無菌實驗室的單一病毒接種，大田自發病毒感染的樣本中病毒種類比較復雜，類型多樣，但不同癥狀樣本感染的病毒類型大體相同，如3個樣本（除1H）都感染了常見的甘薯病毒（如 SPVG、SPV2、SPVC、SPFMV、SPBV-B等甘薯常見病毒）[17-19]，同時本研究中還鑒定到甘薯中不常見的病毒感染（DOVA、PanVY、ScaMV、PenMV等以及幾類細菌噬菌體），這表明甘薯的病原物種類繁多，大田種植需要加緊防護病毒交叉感染，以提高甘薯品質和產量。

通過對病毒類型的分析，筆者推測導致感染性狀之間差異的可能為少數幾個病毒，如Fj01-03這3個樣本都感染了甘薯常見病毒，但性狀卻并不一致，而3個樣本均感染了SPCSV，樣本表現的明顯癥狀也不一致，只有Fj03表現出明顯的褪綠矮化。因此，推斷這些病毒對植株性狀的影響可能取決于病毒的感染程度（病毒濃度），張愛紅等[20]研究表明，玉米粗縮病株葉片內病毒的濃度與植株的病毒癥狀呈現正相關，病毒濃度越高植株病情越嚴重，并且其他研究表明病毒濃度的增加是導致病毒癥狀和代謝干擾程度加深的直接誘因[21-22]，季志強等[22]研究表明，隨著病毒濃度的加深，馬鈴薯脫毒苗的葉片含水量、葉綠素含量、光合和呼吸強度以及代謝干擾程度均下降。因此，高通量測序結合病毒濃度檢測，精準的判定病毒感染種類以及感染程度，對大田農作物病害的診斷和防控具有重要意義。

通過對差異 miRNA的分析，筆者發現這些miRNA的差異表達與病毒感染有關，這與其他文獻報道的 miRNA參與調控植物抵御病原微生物的結果一致[23]。部分miRNA（家族）的差異性表達可能與癥狀相關，如miR-156家族和miR-157家族全部成員同時存在差異性表達，而 miR-166d/e/t、miR-169i/o/u、miR-395b/c/d等 miRNA家族的部分成員在不同癥狀樣本之間具有表達差異。miR-156和miR-157家族的靶蛋白多含SPL結構域（包含SBP盒子），據報道miR-156b的過表達會導致植物高度降低、矮化、分蘗數量增加，并且多與植物的生長發育、脅迫應答有關[24-26]。miR-166家族和miR-169家族的靶基因分別編碼含有 HD-Zip結構域轉錄因子和 K Homology結構域轉錄因子，而這些轉錄因子通過各種途徑參與植物的生長發育、信號傳導、形態建成以及應激反應[26-29]，表明這些miRNA（家族）的靶基因功能具有多樣性。MiR-169家族是植物中最大的miRNA家族，其家族成員與植物的生長發育過程、抗脅迫性明顯相關[30]；HU 等[31]研究表明，番茄（Solanum lycopersicum）的HD-ZipI型轉錄因子SIH24能夠正向調控抗壞血酸鹽的累積，從而增加植物氧化應激耐受性；另外CHEN等[27]研究發現大豆（Glycine max）中59個HD-Zip家族基因對鹽脅迫或者冷脅迫具有應激性表達。另外，通過對部分差異 miRNA的保守性分析，本研究所得的差異 miRNA在馬鈴薯、擬南芥、番茄等作物中的保守性較高，因此，筆者推測這些差異 miRNA通過調控靶基因在甘薯致病性感染和應激過程中發揮重要的作用。

此外，本研究還篩選了新的差異表達miRNA，這些miRNA的靶基因大多為ZFP、WD、Myb、SPL等轉錄因子家族成員，均參與植物的生長發育、信號傳導、離子平衡等，參與并調控植物脅迫、病毒感染、抗逆性等多種生物和非生物脅迫[32-34]。運用GO功能富集分析發現這些差異基因大多與細胞分裂和分化、植株的生長和形態發育相關，另外，這些新的miRNA的靶基因與“植物病原菌互作”相關，這些靶蛋白包括鈣離子依賴性激酶、鈣結合蛋白，或者NBS-NBS-LRR型抗病蛋白，其中鈣結合蛋白參與植物的抗逆性機制[35-37]，NBS-NBS-LRR型抗病蛋白直接或者間接的與病原體因子結合后，激活下游信號，誘導植物細胞的程序性死亡并產生快速防御機制[38]。

4 結論

甘薯病毒感染與病理癥狀以及 miRNA差異表達存在一定相關性，對差異 miRNA靶基因的分析表明病毒感染引起的差異 miRNA靶基因多為轉錄調控因子，這些轉錄因子通過多種形式參與調控植物的生長發育和抗脅迫。通過對病毒種類的差異分析，筆者推測導致不同甘薯樣本之間癥狀差異的因素，不僅與病毒種類有關，還應該與病毒的感染程度有關，因此判定病毒感染種類以及感染程度對甘薯病害的診斷和防控具有重要意義。盡管有許多文獻表明差異表達的miRNA與植物生長和脅迫等相關，但針對植物的生長發育、脅迫應激反應等復雜機制，miRNA挖掘和驗證仍有待進一步研究。

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