抗氟苯蟲酰胺小菜蛾差異表達基因及其通路

王成花，孫詩晴，徐巨龍，趙小龍，薛超彬

（山東農業大學植物保護學院/農藥毒理與應用技術省級重點實驗室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科，主要危害甘藍等十字花科植物，幼蟲取食葉片，苗期集中危害心葉，嚴重影響蔬菜的產量及品質，成為世界性的蔬菜害蟲。氟苯蟲酰胺（flubendiamide）是由日本農藥株式會社和德國拜耳公司聯合開發的一種鄰苯二甲酰胺類殺蟲劑，其主要作用靶標為昆蟲魚尼丁受體（ryanodine receptor，RyR），該藥劑已廣泛應用于鱗翅目害蟲的防治，效果優良，但近年來小菜蛾等鱗翅目害蟲對該藥劑的抗性越發突出。因此，明確小菜蛾對氟苯蟲酰胺的抗性機理對合理控制小菜蛾及其抗藥性發展具有重要意義。【前人研究進展】2008—2011年，泰國Tha Muang地區小菜蛾對氟苯蟲酰胺的抗性由1.5倍發展到4 817倍[1]；2012年，泰國Sai Noi地區小菜蛾對氟苯蟲酰胺的抗性倍數超過750倍；菲律賓 Sudlon地區小菜蛾田間種群對氟苯蟲酰胺的抗性超過1 300倍[2]，2015年該Sudlon種群對氟苯蟲酰胺的抗性超過10 000倍[3]。中國廣東增城地區的小菜蛾田間種群對氟苯蟲酰胺的抗性高達1 779倍[4]。除此之外，其他鱗翅目害蟲也對氟苯蟲酰胺產生了不同程度的抗性，如茶小卷葉蛾（Adoxophyes honmai）對氟苯蟲酰胺的抗性達 105倍[5]；番茄潛葉蛾（Tuta absoluta）對氟苯蟲酰胺的抗性超過1 000倍[6]。抗性機制研究發現，泰國和菲律賓的小菜蛾田間高抗種群中魚尼丁受體基因（PxRyR）的4 946位均存在一個甘氨酸（G）到谷氨酸（E）的突變[7]，其位于受體基因羧基末端的跨膜區附近，且在所有昆蟲魚尼丁受體中高度保守，被認為是導致小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺產生抗性的主要原因。此外，解毒酶活性的提高，如細胞色素 P450單加氧酶活性的提高（P450）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）活性的提高[8-9]；PxRyR中G4946E、E1338D、Q4594L和I4790M等4個位點的協同突變[10]和PxRyRmRNA轉錄表達變化等[4,11-12]，也是小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺產生抗性的重要機制。【本研究切入點】在小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑抗性機制的研究中，多數報道均以氯蟲苯甲酰胺為藥劑對象，但小菜蛾對氟苯蟲酰胺與氯蟲苯甲酰胺的抗性機制是否一致，目前還未有明確的認識。【擬解決的關鍵問題】以小菜蛾抗氟苯蟲酰胺品系為試材，從轉錄組水平研究小菜蛾對氟苯蟲酰胺的抗性機制，進一步揭示其抗性機理。

1 材料與方法

試驗于 2016年在山東農業大學和深圳華大基因科技服務有限公司完成。

1.1 供試材料

小菜蛾敏感品系（S）于2006年采自山東農業大學南校區實驗站園，在室內不接觸任何藥劑，用甘藍苗長期飼養且穩定繁殖；抗氟苯蟲酰胺品系（Rh）是敏感品系小菜蛾在氟苯蟲酰胺藥劑的持續選擇壓力下篩選至28代（Rh28），其抗性倍數為397.08倍；田間抗性種群（Rz）于2012年10月采集于廣州增城市周邊蔬菜田，在室內無農藥暴露情況下繁殖到第 36代（Rz36），與 S品系相比，該種群對氟苯蟲酰胺藥劑的抗性倍數為98.12倍。

1.2 RNA提取及檢測

選取標準一致的小菜蛾3齡幼蟲，迅速用液氮冷凍，用RNAsimp Total RNA Kit試劑盒提取RNA，并利用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的質量較高RNA樣品送至深圳華大基因科技服務有限公司，利用Illumina HiSeqTM2000進行高通量測序。每個樣品提供3次重復。并對質檢合格的數據進行對比，包括抗氟苯蟲酰胺品系與敏感品系對比（Rh28-vs-S）、抗氟苯蟲酰胺田間抗性種群與敏感品系對比（Rz36-vs-S），及抗氟苯蟲酰胺品系與抗氟苯蟲酰胺田間抗性種群對比（Rh28-vs-Rz36），并進行相關生物信息分析。

1.3 基因定量方法

將3組樣品間兩兩比較，用RSEM工具[13]進行基因表達定量。表達定量的結果以FPKM為單位，具體計算公式如下：

式中，FPKM（A）表示為基因A的表達豐度，C為唯一比對到基因A的fragments數，N為唯一比對到參考基因的總fragments數，L為基因A編碼區的堿基數。FPKM法能夠消除由于基因長度和測序質量差異的影響，使得到的基因量更加準確地比較不同樣品間的表達差異。

1.4 明確差異基因

為了挖掘樣本間的顯著差異基因，基于泊松分布的分析方法，并參照 AUDIC等[14]的方法，假設觀測到基因A對應的reads數為x，已知在一個大文庫中，每個基因的表達量只占所有基因表達量的一小部分，在這種情況下，x的分布服從泊松分布：

之后，對差異檢驗的P值作多重假設檢驗校正，通過控制FDR（False Discovery Rate）來決定P值的域值[15]。在得到差異檢驗的FDR值同時，根據基因的表達量（FPKM值）計算該基因在不同樣本間的差異表達倍數。FDR值越小，差異倍數越大，則表明表達差異越顯著。本研究中，顯著差異表達基因定義為FDR≤0.001且倍數差異在2倍以上的基因。

1.5 GO顯著性富集分析

基因本體（Gene Ontology，GO）共有3個本體，分別描述基因的分子功能（molecular function）、細胞成分（cellular component）和參與的生物過程（biological process）。GO分析給出與參考基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO功能條目，從而篩選出差異表達基因與哪些生物學功能顯著相關。本研究首先把所有差異表達基因向Gene Ontology數據庫（http://www.geneontology.org/）的各個term映射，計算每個term的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達基因行使的主要生物學功能。

1.6 KEGG顯著性富集分析

京都基因與基因組百科全書數據庫（KEGG）是關于通路（Pathway）的主要公共數據庫，Pathway顯著性富集分析應用超幾何檢驗，該分析的計算公式同GO功能顯著性富集分析。在差異表達基因中只有滿足Q值≤0.05才屬于顯著富集的 Pathway。通過Pathway顯著性富集分析，能夠確定差異表達基因參與的最主要的生化代謝途徑以及信號轉導途徑。

2 結果

2.1 差異表達基因

通過將抗氟苯蟲酰胺品系（Rh28）與敏感品系（S）的RNA-seq數據對比發現，Rh28中共有540個顯著差異表達基因，其中上調表達的基因411個，下調表達的有129個（附表1）；同樣的，將田間抗性種群（Rz36）與S品系的RNA-seq數據對比發現，Rz36中共有439個顯著差異表達基因，其中上調表達的基因299個，下調表達的有140個；進一步將Rh28品系與Rz36種群數據對比發現，Rh28中共有75個顯著差異表達基因，其中上調表達的48個，下調表達的有27個。

2.2 顯著差異表達基因的基因本體（GO）分析

在得到每個差異基因的GO注釋后，用WEGO軟件[16]對 3個品系/種群間的對比（Rh28-vs-S、Rz36-vs-S和 Rh28-vs-Rz36）得到的差異基因 DEGs從生物過程/細胞組件和分子功能3大類進行分類統計，從宏觀上認識差異基因的功能分布特征（附圖1）。其中生物黏附（biological adhesion）、生物調節（biological regulation）、代謝進程（metabolic process）、免疫系統進程（immune system process）、對刺激物的反應（response to stimulus）、催化活性（catalytic activity）、酶調節活性（enzyme regulator activity）、結合因子（binding）、受體激活（receptor activity）、轉運活力（transporter activity）、核酸綁定的轉錄因子激活（nucleic acid binding transcription factor activity）等功能都均與小菜蛾的抗性及免疫系統具有相關性。

2.3 顯著差異表達基因的通路（pathway）分析

利用 KEGG數據庫，對 Rh28-vs-S、Rz36-vs-S和Rh28-vs-Rz363組樣品的差異表達基因可能參與或涉及的通路（pathway）進行分析，結果發現，Rh28與S品系之間共有14 527個被注釋到188條pathway上，其中包含基因數量最多的一條是代謝通路（metabolic pathway），共有2 591個基因，占總數的17.84%，與抗性相關的 pathway還包括藥物代謝——細胞色素P450（drug metabolism-cytochrome P450）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）、促分裂素原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、外來物質代謝的細胞色素 P450（metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、心肌收縮（cardiac muscle contraction）、GABA能突觸（GABAergic synapse）、咖啡因代謝（caffeine metabolism）、黑色素生成（melanogenesis）等。

Rh28與S品系之間540個顯著差異的基因有289個被注釋到通路當中，其中顯著性富集（Q值＜0.05）的pathway只有1個，即過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路（PPAR signaling pathway）。Rz36與S品系之間的差異基因中有237個被注釋到了KEGG數據庫中，得到172條pathway，其中顯著富集的也只有1個，即 ubiquitin mediated proteolysis。而 Rh28與 Rz36品系之間的75個顯著差異性基因有56個注釋到了通路當中，得到71條pathway，沒有顯著富集的通路。KEGG富集排名前20的pathway散點圖見附圖2。

2.4 抗性顯著上調基因

統計Rh28-vs-S，Rz36-vs-S和Rh28-vs-Rz363組間顯著上調的基因數據發現，與S品系相比，Rh28品系顯著上調的411個基因中，有218個在Rz36種群中同樣顯著上調表達。Rh28相對于Rz36顯著上調的48個基因中，有 25個是Rh28品系特有的上調表達基因，而在Rz36種群中表現不顯著（圖1）。針對上述218及25個上調基因展開進一步研究。

2.5 抗性顯著上調基因的GO分析

圖1 上調表達的基因在小菜蛾不同種群中的分布Fig. 1 Distribution of up-regulated express genes in different populations of P. xylostella

Rh28-vs-S和Rz36-vs-S顯著上調的218個交集基因，在GO 3大本體所占的比例及數目分布情況如圖2-a所示；Rh28-vs-S和Rh28-vs-Rz36顯著上調的25個交集基因如圖2-b所示。結果表明，這部分交集差異基因在GO本體中的分布情況與前述的整體的分布情況基本一致，集中在代謝進程、對刺激物的反應、生物調節、催化活性、結合因子等方面。數據分析表明，RNA-Seq獲得的小菜蛾上調的DEGs中，參與生物過程的基因占比較高，達50%以上。

對Rh28-vs-S與Rz36-vs-S交集的218個上調基因，注釋到GO數據庫BP中，將具有相同生物學功能的基因整合到一起（附表2）。部分差異基因在BP中所占的比例及數目見圖3，其中主要涉及脂質代謝、蛋白質代謝、氨基酸轉運和代謝、能量代謝、對環境壓力的反應、對刺激物的反應、防御反應機制及轉運等過程，附表3列舉了Rh28-vs-S與Rh28-vs-Rz36交集上調的25個基因所參與的BP。

2.6 抗性顯著上調基因的KEGG分析

為了較為準確地定位顯著差異表達上調基因參與的生物學功能，針對其所參與的 pathway，通過查找統計KEGG數據庫，發現Rh28-vs-S和Rz36-vs-S顯著上調的218個交集基因中，能夠注釋到數據庫的基因僅有 108個，主要集中在代謝通路上，有 110個（50.45%）基因在KEGG數據庫中沒有詳細的代謝通路圖。小菜蛾響應氟苯蟲酰胺藥物選擇壓力下差異顯著的表達基因富集到的通路有：代謝通路、PPAR信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等。同一個基因可能同時注釋到多條pathway之中，經統計，列舉了部分可能與抗性相關的通路（圖4）。

圖2 上調交集基因在GO分析中的分布Fig. 2 Distribution of up-regulated intersection genes in GO analysis

圖3 上調交集基因部分BP注釋Fig. 3 Up-regulated intersection genes annotated to the corresponding BP

圖4 上調交集基因中與小菜蛾抗氟苯蟲酰胺相關的部分通路Fig. 4 Partial pathway associated with the resistance to flubendiamide in P. xylostella

2.7 抗性相關基因的聚類分析

利用高通量數據，對與殺蟲劑抗性相關的基因進行了動態的監測，并從中篩選出可能與抗藥性相關的通路基因，繪制了聚類熱圖（圖5）。通過聚類熱圖的紅色區域，可以看出Rh28品系與Rz36種群顯著表達量上調的基因，很多集中在內質網上蛋白質的加工、酪氨酸代謝、咖啡因代謝、Wnt信號通路。

3 討論

隨著高通量測序技術日益成熟，為小菜蛾抗藥性研究提供了新方法，通過進行小菜蛾基因的篩選與鑒定，進而分析基因的差異表達，對深入闡述小菜蛾的抗性機制具有重要意義。本文通過基因序列篩選，從小菜蛾S、Rh28和Rz36品系/種群的RNA-Seq序列信息中鑒定出多個與殺蟲劑靶標及解毒代謝相關的基因，對這些差異表達基因在GO以及KEGG數據庫進行功能預測與分類注釋，從獲得的2萬多條差異表達基因序列中，篩選出滿足差異顯著性表達條件的只有幾百條，這部分顯著差異的序列，在GO數據庫中差異表達基因顯著富集的生物過程均在應激反應（response to stress）和防御反應（defense response）中，導致小菜蛾對氟苯蟲酰胺抗性產生的基因主要集中在這部分生物過程中，其生物學功能可能與小菜蛾的抗性之間存在一定的相關性。

通過對差異基因的Pathway統計，信號通路主要集中于PPAR信號通路、蛋白質在內質網上的加工、甘油磷脂代謝、解毒酶代謝等。PPAR是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ3種表型，其中以PPAR-γ的研究最為深入。現有的研究已證實 PPAR-γ主要參與調控脂肪和糖類的代謝、能量平衡等多種生物學功能的調節，小菜蛾的體內脂肪酸 LPL、膽固醇、甘油磷脂等各種脂類的代謝相關以及信號受體激活等一系列連鎖反應[17]。蛋白質在內質網上的加工，主要參與協助一些蛋白質裝配或者折疊，這類蛋白主要是Sec23蛋白和Hsps分子伴侶蛋白，它們與能量代謝、次級代謝途徑密切相關。參與各種氨基酸、嘌呤，代謝產物（萜類、半萜類）代謝及生物合成、糖酵解；能量代謝過程中K/Na離子通道ATPase表達上調。研究表明，氯蟲苯甲酰胺能顯著影響甜菜夜蛾幼蟲中樞神經元的興奮性，使電壓門控鈉通道電流密度和通道功能發生改變，試驗結果說明鈉離子通道亦是氯蟲苯甲酰胺的作用靶標之一[18]。本文通過聚類熱圖分析發現，上調表達的基因很多集中在內質網上蛋白質的加工、酪氨酸代謝和 Wnt信號通路中，與前人研究結果基本一致。

圖5 小菜蛾抗氟苯蟲酰胺相關基因表達分析Fig. 5 Expression profiling of genes associated with the resistance to flubendiamide in P. xylostella

谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）作為一種超基因家族酶類，可催化昆蟲因各種化學藥劑產生的有害物質的代謝。依據GSTs所處的細胞位置和功能，主要分為微粒體、線粒體和胞質型，而在昆蟲中這種酶主要屬于胞質型，其家族中的Delta家族（昆蟲中特有的GSTs家族之一）[19]，在生物體內起到的作用主要包括催化活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性、谷胱甘肽轉移酶活性及裂解酶活性等，這些均與昆蟲的代謝活性相關。研究發現，抗氯蟲苯甲酰胺品系小菜蛾的GSTs 活性是敏感品系的3.34倍，因此GSTs可能在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的代謝抗性中發揮著主要作用[9]，且本文的研究也表明主要富集于谷胱甘肽代謝的 2個基因（XM_011569702.1、XM_011557174.1）表現為顯著表達上調。

細胞色素 P450在昆蟲生長發育及繁殖等方面起著重要作用，并且在次生物質和殺蟲劑代謝方面也有重要作用，在COG數據庫中，細胞色素P450被注釋到了次生代謝產物的生物合成（second-metabolites biosynthesis）、運輸和代謝（transport and catabolism）功能中，這也充分說明了細胞色素 P450是昆蟲體內主要的代謝解毒酶之一[20]。其中編碼 CYP2的基因（XM_011556598.1）表達量上調顯著，而且已有研究報道CYP家族的細胞色素P450解毒酶在一些昆蟲體內與抗藥性密切相關[21]。

經過部分篩選分析，從小菜蛾中鑒定出多個熱激蛋白（Hsp），發現該抗性小菜蛾體內的 Hsp的多個家族（如 Hsp40、Hsp70、Hsp90）表達量顯著上調，并且參與了多個生物工程，筆者認為Hsp很可能與昆蟲的抗性以及對環境的應激性有關，而且在GO數據庫中，這些Hsp家族差異基因均注釋進入了“對刺激物的反應”和“細胞蛋白質代謝過程（cellular protein metabolic process）”功能中，同時“對刺激物的反應”的功能注釋更加表明了 Hsp可能與小菜蛾抗藥性的產生有著密切的聯系。Hsp基因家族可被壓力誘導，在環境壓力因素下，如重金屬離子、極端溫度、營養缺失、氧自由基及細菌或者病毒感染都有可能誘導熱激蛋白的過量表達[22]。在粉虱類的抗逆基因研究中已經有過類似的報道，可能由于昆蟲的這種蛋白可以應對環境中存在的極端脅迫壓力[23-24]，導致一些入侵性的有害生物在分布地域方面不斷擴大[25]。已有研究證實在高溫、低溫、輻射、干旱和農藥等的環境壓力下，都能夠誘導昆蟲體內不同Hsp的表達，這證實了Hsp可以提高昆蟲對不良環境的耐受能力，從而保護昆蟲免受和少受脅迫的傷害。如溫度馴化的南美斑潛蠅（Lirionyza huidobrebsis），其體內Hsp70基因大量表達，在性狀方面耐熱能力也顯著提高，表明Hsp表達和昆蟲耐熱性的獲得有著密切關系，而且耐熱性的誘導和消退動力學與Hsp的誘導和降解存在著平行關系[26]。抗有機磷類殺蟲劑的搖蚊（Chiromomus yoshimatsui）品系Hsp的表達水平與敏感品系相比，是敏感品系的2—3倍，表明Hsp上調增強了昆蟲的抗藥能力[27]。本研究發現，小菜蛾抗氟苯蟲酰胺品系的谷胱甘肽-S-轉移酶、細胞色素 P450解毒酶及參與昆蟲多種生理反應的熱激蛋白超基因家族等基因的表達量均顯著上調，與前人研究基本一致。因此，今后需要對這些基因及其所在的通路進行深入研究，進一步明確其抗性機制。

昆蟲靶標基因的mRNA表達量變化也是昆蟲抗藥性產生的原因之一。本研究中小菜蛾田間抗性種群魚尼丁受體相關8個基因表達量均下調，而且有6個顯著下調。LIN等[28]通過比較轉錄組測序發現，對氯蟲苯甲酰胺產生不同抗性水平小菜蛾種群的魚尼丁受體mRNA的表達量均顯著下調；WAN等[29]利用RNAi干擾馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）魚尼丁受體的表達后，再用氯蟲苯甲酰胺處理，馬鈴薯甲蟲的死亡率明顯降低；YANG等[30]在白背飛虱（Sogatella furcifera）的研究中也發現了類似結果。這些結果均表明魚尼丁受體基因表達量的下調可能會增強昆蟲對雙酰胺類藥劑的抗性。筆者實驗室正在開展魚尼丁受體表達差異基因的驗證工作，以明確該類基因在小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑抗性中所起的作用。

4 結論

通過轉錄組測序（RNA-Seq）獲得了小菜蛾抗氟苯蟲酰胺差異表達基因及抗性顯著上調表達基因，其主要富集于代謝過程、應激反應及對刺激的反應等條目中，這些基因的相互協同調控是小菜蛾對氟苯蟲酰胺產生抗性的重要機制。

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