針刺預處理對大鼠缺血心肌線粒體通透孔開放的調節

宋春華，丁 續，王保葉，付嘉明，徐紅飛，公維志，董勤建，李曉艷，郭丹丹，金艷紅，閆 珺，亢連茹

（1.黑龍江中醫藥大學， 哈爾濱 150040 ；2.儀隴縣人民醫院，四川 南充 637600 ）

目前，心血管病發病率呈逐年上升趨勢，約有1 700萬人每年死于該病[1]，成為危害健康三大殺手之一[2]。減少其發生、降低患者病死率、提高生存質量是目前本病研究的方向[3-4]。MIRI發生時線粒體膜結構和功能發生改變，與mPTP等關系密切。本文為針刺心俞預處理調節mPTP開放的相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動物 ：Wistar雄性大鼠96只（青島派特福德白鼠養殖專業合作社）。體質量210 g。試劑：上海華藍化科公司 1%伊文思藍及2，3，5-氯化三苯基四氮唑、上海寶曼科公mPTP熒光檢測試劑盒。中生北控公司DAB顯色試劑盒、鼠抗多克隆一抗、PV6002。儀器：北京眾實迪創科技Kent ScientificA03-003型小動物呼吸機 、日本OLYMPUS公司激光共聚焦顯微鏡LSM510、美國Media Cybernetic公司Image-Pro Plus圖像分析軟件、中國尤尼柯公司紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 禁食12 h，自由飲水。隨機分空白、模型、實驗、對照組，每組分即刻、24 h、48 h組。除空白組，其他組各時間組結扎法 MIRI造模后取材。空白組：造模前固定30 min不處理；1次/d，連續15 d，不造模。模型組：造模前同空白組；MIRI造模。實驗組：造膜前15 d針刺；1次/d，30 min/次，共15 d。對照組：造模前同空白組；造模時，冠脈結扎前先阻斷血流5 min，再灌流5 min；連續重復3次，缺血預處理30 min。

1.2.2 穴位定位及針刺預處理方法 心俞定位根據《實驗針灸學》穴位圖譜。操作：1）心俞：T5棘突下旁開約7 mm；直刺0.3～0.4 cm接G6805-Ⅱ電針；2）參數：頻率20 Hz，電壓3 V，連續波；3）強度：大鼠出現與電針同頻率輕微顫抖為宜。連續15 d針刺（電針）。

1.2.3 MIRI/缺血預處理動物模型的制作 參照文獻[5-10]傳統方法進行。

1.2.4 激光共聚焦檢測

1.2.4.1 mPTP檢測原理 采用活體細胞mPTP熒光檢測盒，觀察線粒體通透孔：線粒體內熒光的強度高為線粒體完好，膜通透孔呈關閉狀態，反之表明線粒體破壞，膜通透孔開放狀態。

1.2.4.2 mPTP檢測步驟 1）把心肌細胞懸浮液移到離心管，放置離心機，速度為2 000 r/min，離心5 min。2）取出離心管之上清液，加100 μL 清理液Reagent A（37 ℃），充分反應之完全分離細胞；把液體再離心，方式同1）。3）取上清液，分別加進100 μL染色液Reagent B和中和液Reagent C，把離心管內細胞充分染色，放至37 ℃細胞培養箱20 min充分染色，避光，離心同1）。4）抽棄上清液，加進100 μL Reagent A清理液（37 ℃），清洗細胞；離心同1）；棄上清液。5）重復實驗步驟同4）。6）加進100 μL清理液Reagent A（37 ℃），清洗細胞。7） LSCM觀察：移液槍取10 μL離心管內液體，均勻涂至載波片，蓋蓋玻片，放至LSCM下。啟動LSCM，參數激發波長488 nm，散發波長505 nm觀察心肌細胞mPTP開放。

1.2.5 凋亡相關蛋白表達 空白組及模型組每日不處理，對照組處理同1.2.1，實驗組每日電針心俞，連續15 d，第15天治療后 30 min 造模，6 h后取心肌組織，免疫組化法觀察C凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2 表達。每只大鼠取 2 張切片，每張切片取 5 個連續不重復視野。以10 個視野陽性C數平均值記數。200 倍光鏡下統計Caspase-3、Bcl-2陽性C數。

1.3 統計學方法 用SPSS 19.0 統計軟件處理，實驗數據用均數±標準差（）表示。正態性檢驗數據，多組組間比較用單因素方差。組間比較方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用Tamhane’s T2法檢驗。

2 結果

2.1 不同時間組mPTP熒光強度比較 見表1。

表1 不同時間組mPTP熒光強度比較（ ，n = 24）

表1 不同時間組mPTP熒光強度比較（ ，n = 24）

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與實驗組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 即刻組 24 h組 48 h組空白組 51.19±2.13 52.29±1.98 50.12±1.68模型組 21.36±1.82# 22.23±1.78# 23.01±1.84#實驗組 31.16±1.30△ 43.35±2.02△△ 37.68±2.01△對照組 31.13±1.40 30.46±1.54▲▲ 29.85±1.15▲

2.2 Caspase-3及Bcl-2表達的陽性細胞數 見表2。

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表達的陽性細胞數（ ，n = 24） ‰

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表達的陽性細胞數（ ，n = 24） ‰

注：與模型組比較，## P＜0.01； 與對照組比較，△△P＜0.01

組 別 bcl-2 caspase-3空白組 153.83±19.21 116.82±8.74模型組 46.78±16.34 354.45±22.32△△實驗組 298.37±49.18##△△ 154.28±21.03##△△對照組 189.93±45.24## 227.24±17.32##

研究表明，4組不同時間對mPTP均有影響。實驗不同時相MIRI心肌C mPTP開放程度不同。從表1可看出：1）熒光強度比較，模型組最弱，缺血程度相對最重（P＜0.05）；2）與模型組比較實驗各組熒光強度均升高（P＜0.01，P＜0.05）；3）實驗組即刻較對照組熒光強度無統計學意義（P＞0.05），實驗組24、48 h較對照組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05）。

實驗表明，對照組與實驗組均抑制mPTP開放，且調控作用24 h最好，48 h相對良好。實驗組下調 Caspase-3 及上調Bcl-2 表達明顯優于對照組。說明電針心俞預處理可能通過調整mPTP開放，下調Caspase-3 、上調Bcl-2 表達而保護缺血心肌的。

3 討論

mPTP被稱為最重要抑制細胞凋亡孔道[11]。mPTP存在于線粒體膜上，確保線粒體內外理化因子和生物活性物通過；C失活后，各種凋亡因子刺激其失活性開放，使得線粒體腫脹變形等，心肌功能障礙，最終心肌壞死。LSCM[12]是當前研究mPTP最有效方法之一。本研究用LSCM分析mPTP開閉程度，觀察電針心俞預處理防控缺血心臟病機制[13]。

中醫學認為，心俞為心之背俞，為治療心臟疾病要穴。針刺可調心脈氣血，通調陰陽，心臟得到精氣濡養，氣血充盛，邪不可干。從解剖學看，心臟相關神經布于心俞處，電針及預處理心俞可一定程度改善急性心肌缺血[14-15]；減輕心肌損傷，抑制線粒體凋亡，控制mPTP開放[16]，對心肌有保護作用。

本研究結果證實，實驗組對缺血不同時間心肌保護作用有差異，且隨時間改變呈增強-峰值-減弱趨勢；實驗24 h組可能為最佳治療時間；實驗組下調 Caspase-3及上調Bcl-2 蛋白表達明顯優于對照組。電針預處理心俞保護MIRI損傷心肌作用，其機制可能通過調控相關基因蛋白及mPTP開放，減少凋亡實現的。

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