艾灸對FCA誘導的AA模型大鼠心肌超微結構及血清代謝組學的影響

朱 艷，俞紅五，潘喻珍，楊 佳，吳炳坤，胡 雪，曹云燕

（安徽中醫藥大學第二附屬醫院老年病科，合肥 230061）

類風濕關節炎（RA）是一種可以影響全身的自身免疫性疾病，病變不僅引起關節炎癥，還可引起肺、心等重要臟器的損傷，其中RA造成的心血管系統損傷為正常人群的3～4倍，甚至有人提出RA和糖尿病一樣可作為心血管疾病的獨立危險因素[1-3]。艾灸作為祖國醫學中最為常用的外治方法，可以溫經通絡、活血化瘀，以改善全身及局部的血液循環，促進機體的新陳代謝，從而扶正祛邪，有效的治療疾病[4]。本研究通過代謝組學方法尋找艾灸調節RA的標志性代謝產物及其代謝通路，以明確相關物質的變化趨勢，初步探索艾灸干預RA作用機制，為RA治療提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar雄性大鼠80只，體質量（180±30）g，鼠齡5～6月，由南京生物醫藥研究院提供，動物合格證號：SCXF（蘇）2015-0001。實驗室保持恒定的溫度和濕度，大鼠在明暗時間為12/12 h（明期7:00～19:00）條件下進行飼養。本實驗通過動物倫理委員會批準。

1.2 儀器、試劑及藥品 FCA購自美國SIGMA公司；TPT：10 mg/片，上海復旦復華藥業有限公司；特制香煙型純艾條（直徑1 cm，南陽市臥龍漢醫艾絨廠）。儀器：美國安捷倫公司GC/MS，型號為7890A/5975C。

1.3 造模方法 采用風、寒、濕環境因素+生物因子復合造模方法[4]復制AA模型。所有除了NC組以外的大鼠均放入造模環境中20 d。于第21天在大鼠右后足跖部注射FCA 0.5 mL/只，致炎，以建立AA模型。然后觀察3 d，其中以24 h后見足踝部急性炎性腫脹，以48 h見對側肢體或前肢，甚至尾部、耳朵炎性結節或紅腫出現示造模成功。

1.4 分組及治療 將大鼠分為NC組20只，造模成功的大鼠按隨機數字表隨機分為MC 20只、TPT組20只和艾灸組20只。艾灸組：參照文獻[5]選取腎俞、足三里穴，按照大鼠穴位圖譜定位穴區，剪去各穴位置區域的被毛，標記為紅色。造模成功3 d后，予艾條在距穴位2 cm處懸灸；治療時，1次/d，選1穴，2穴交替使用，20 min/次，連續治療15 d。TPT組：以TPT溶液灌胃，按照8 mg/（kg·d）劑量，1次/d，共15 d[6]。NC組和MC組：予以生理鹽水灌胃。

1.5 檢測指標及方法 1）關節腫脹度測量[5]：分別在造模前1 d、造模后3 d、最后1次治療24 h量取各組每只大鼠的右側后足跖的容積，以算取每個大鼠的足跖腫脹度。2）AI測定[7]：分別在造模前 1 d、造模后3 d、最后1次治療24 h評估全身各個關節病變的程度。根據5級評分法進行評價，依據右后肢體外的其余3個肢體的病變程度來累積積分，從而計算出AI。計分標準為0分：無紅腫；1分：小趾關節紅腫；2分：趾關節和足跖腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內的全部足爪腫脹。把每個關節積分相加即得每只大鼠的AI。3）電鏡觀察 ：在最后1次治療24 h后每組取7只大鼠，用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉大鼠后開胸取出心臟，留取左心室游離壁中層的心肌組織，切成1 mm3的小塊（在冰上操作），立即放于裝有戊二醛的緩沖液中，于4 ℃，固定2 h以上，用磷酸緩沖液浸洗約30 min，然后用四氧化鋨固定液在4 ℃固定2 h，再以磷酸緩沖液浸泡沖洗，然后選乙醇梯度進行脫水，再以環氧樹脂Epon 812 浸透、然后包埋，美蘭染色后在光學顯微鏡下定位，以超薄切片機切成超薄片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，最后在透射電鏡下觀察、拍照。4）代謝組學檢測：血清代謝組學檢測，最后1次治療24 h后，每組取5只大鼠，取每只大鼠全血2 mL放在普通生化管內，然后離心以3 000 r/min 速度持續10 min，吸取上層血清，儲存于- 80 ℃冰箱內以進行代謝組學檢測。在配置血清樣品時，取兩倍體積的填酸鹽緩沖液和一份血清混合，以抵消pH對化學位移的影響，然后加入適量Dss用作化學位移零點的定標。在配好后滴進5 mm樣品管并于Vari-an Unity plus 500 MHz譜儀上進行釆集樣品的一維'H-NMR譜圖。該實驗選用5 mmHCN三共振探頭，300 K的溫度，5 kHz的譜寬，信號共累加256次，釆樣點數為16 k，釆樣NOEPR-CPMG脈沖序列，其中抑制水峰信號選用預飽和脈沖序列，抑制由蛋白和脂蛋白等產生的寬峰，采用CPMG自旋回波序列從而得到窄的譜線。譜圖預處理，用自編軟件和MestRe-C 2. 3軟件對譜圖實行譜峰對齊、基線校正以及手動調相。對在50.2～4.6區域范圍內的則行自適應積分，選用Pareto標度化對數據進行預處理后；然后對積分數據歸一化以構成數據矩陣，進行PCA和PLS-DA方法被選用對數據矩陣行統計分析。采用載荷圖和得分圖以分析結果并表示分析所得結果。

1.6 統計學方法 尋找差異性代謝物最常用的方法之一是PLS-DA分析[8]。依據其變量重要性投影（VIP）＞1為閾值提示是有差異的代謝物。采用SPSS 17. 0統計軟件，考察代謝物含量差異的顯著性采用單因素方差分析，組間單維P檢驗多維統計結果采用t檢驗，其中P＜0.05表示有統計學意義。若同時滿足單維統計P＜0.05和VIP＞1的代謝物才是最終差異代謝物[9]。

2 結果

2.1 4組大鼠關節足跖腫脹度和AI的比較 見表1。

表1 4組大鼠足跖腫脹度和AI的比較（，n = 20）

表1 4組大鼠足跖腫脹度和AI的比較（，n = 20）

注：與NC組比較，## P＜0.01；與MC組比較，△△P＜0.01；與艾灸組比較，▲P＜0.05

指 標 NC組 MC組 TPT組 艾灸組致炎前1 d足跖腫脹度/% 1.81±0.19 1.80±0.17 1.79±0.12 1.82±0.11致炎后3 d足跖腫脹度/% 1.89±0.13 3.03±0.12## 2.91±0.17## 2.94±0.16##致炎后18 d足跖腫脹度/% 1.91±0.23 2.62±0.07## 2.42±0.09△△ 2.32±0.10△△致炎后 3 d AI 值 /分 0 9.31±0.76## 9.36±1.05## 9.20±01.07##致炎后18 d AI 值/分 0 6.79±1.19## 4.61±0.91△△▲ 3.57±0.89△△

2.2 病理學結果 NC組大鼠線粒體膜邊界清晰，嵴縱行排列密集有規律，橫紋排列清晰有序；MC組大鼠的線粒體膜邊界不清，腫脹明顯，嵴稀疏，橫紋大部分消失，體內大部分呈空泡狀態；TPT組大鼠線粒體輕度腫脹，有輕度空泡化，嵴和橫紋排列輕度紊亂但尚清楚；艾灸組大鼠線粒體呈橢圓形或長方形排列于肌纖維間，略腫脹，膜尚清晰，嵴和橫紋分布基本整齊有序。

2.3 血清樣本的總離子流色譜圖（TIC） 見圖1。肉眼可見的每個 TIC 圖上的色譜峰下可能包含若干個共流出峰，數據復雜。大量的色譜峰均被GC/MS從每個樣本中檢測到。采用軟件算法對采集到的質譜數據進行預處理分析，將復雜的質譜信號轉化成有用定性定量數據。同時，在以下分析中選用多維統計和單維統計相結合的方法來獲取組學特征，以表征群體之間的代謝特征。

2.4 PCA 輪廓分析 PCA 模型常用于真實地反映各組間的差異，但是由于代謝組較基因組、轉錄組和蛋白質組過于靈敏，因此受到遺傳背景和環境干擾的影響比基因組、轉錄組和蛋白質組要大，如果組間差異較小，這個模型對于哺乳動物來說，通常無效。為了消除這種影響，通常采用監督性模型，如PLS-DA。用模型質量參數R2X（X 模型的解釋率）、R2Y（Y觀察量即組間差異的解釋率）、Q2（預測率）來表示模型質量。一般來說，它們的值大于 0.5，即表示模型質量較好[10]，血清組PCA-X4個主成分R2X =0.52；因此，用2種PCA法建立的模型具有較高穩定性。

2.5 PLS-DA 從各組血清PLS-DA得分圖可知，以模型的可解釋指標R2X和可預測指標Q2，血清PLS-DA 2個主成分 R2X = 0.24，R2Y = 0.594，Q2 = 0.161。結果提示，所建立的數學模型比較可靠，說明組間代謝組的差異比較顯著。

圖1 血清樣本的總離子流色譜圖（TIC）

2.6 血清中潛在的生物標志物信息 見表2。MC組較NC組的變化主要體現于葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對甲酚、花生四烯酸增強；艾灸組的變化較MC組的變化主要體現于葡萄糖增強，對甲酚減低；TPT組的變化較MC組的變化主要體現于葡萄糖和丙氨酸增強，對甲酚和花生四烯酸減低；TPT組的變化較艾灸組的變化主要體現于葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對甲酚增強。

表2 血清中潛在的生物標志物信息

3 討論

艾灸為傳統的中醫外治方面，艾灸的繼承與發揚，需要現代先進的科學方法與技術的詮釋。代謝組學是一種具有整體水平的研究方法，符合中醫整體觀和陰陽動態平衡觀，又與艾灸能夠整體性調節機體的作用相契合。因此，采用代謝組學方法深入的對艾灸治療RA作用機制進行探討符合研究的實際需要，將有利于系統地闡釋艾灸治療RA的作用機制，同時推動艾灸療法在臨床中的運用。

本研究從AA大鼠血液代謝組學中發現，變化過程的代謝標志物為葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、對甲酚、花生四烯酸、蔗糖，其中擾動的代謝通路主要涉及：糖類代謝、氨基酸代謝、腸內菌群及脂肪酸代謝。

脂肪、蛋白質和糖類為體內三大營養物質，與能量代謝密切相關。糖代謝具體包括糖酵解、有氧氧化等代謝途徑，即能提供能量為機體，又可以通過信號通路或網絡來調節機體的生理機能。研究[11-12]發現，糖酵解與RA的發病機制及疾病進展密切相關，并認為RA中糖代謝活動增強從而導致相關基因的表達異常。

鳥氨酸是由精氨酸分解而來，而精氨酸是通過一氧化氮途徑來發揮免疫調節作用，使免疫球蛋白產生從而在機體免疫方面起重要作用[13]。丙氨酸是葡萄糖形成過程當中的主要物質，而丙氨酸與葡萄糖還構成一個循環即丙氨酸-葡萄糖循環，因此，機體從血液中吸收大量丙氨酸來促進糖代謝為機體供能，從而加強自身免疫[14]。

眾所周知，許多免疫活性細胞參與RA的發病，前列腺素E2是非常重要的致炎因子、且是花生四烯酸的代謝產物。而花生四烯酸又是白三烯的前體，白三烯B4與動脈粥樣硬化有關[15]，同時是體內非常重要的炎癥反應調節因子，它不僅能夠激活多種炎性和免疫效應細胞而且能夠聚集上述細胞。現代研究[17]發現，RA患者體內白三烯B4的濃度明顯升高，與關節腫痛、關節破壞密切相關[16]。

對甲苯酚是苯丙氨酸于腸內在厭氧菌群的作用下產生，在AA大鼠血清中發現該物質，說明了AA大鼠體內腸道菌群代謝發生擾動。

本實驗結果亦發現，AA大鼠血清中葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對甲酚、花生四烯酸增強；經艾灸干預后葡萄糖增強，對甲酚減低；說明艾灸參與了糖類、腸道菌群及脂肪酸的代謝。而相較于TPT組來說，艾灸組葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖增強，對甲酚低下，說明艾灸亦參與了氨基酸代謝。

由上可見，艾灸能明顯改善RA炎癥反應，同時能夠保護心肌，調控氨基酸、脂肪酸代謝及腸內菌群代謝可能是艾灸治療RA的特異性體現。

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