竹節(jié)香附素A調(diào)控mTOR通路對(duì)腸癌HCT116細(xì)胞自噬及凋亡的影響*

孟春芹,滕鈺浩，吳存恩，王瑞平

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院腫瘤科，南京 210029)

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在美國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)工作組統(tǒng)計(jì)1999-2008年美國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率時(shí)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別列第4位和第2位。根據(jù)中國(guó)健康狀況調(diào)查等統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)大腸癌發(fā)病率略低于歐美，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均列第5位[1]。在大腸癌的綜合治療中，手術(shù)是惟一具有根治效果的治療方案，但多數(shù)患者在確診時(shí)，已處于進(jìn)展期，化療在進(jìn)展期大腸癌治療中扮演重要角色。然而，化療耐藥和藥物不良反應(yīng)，限制了其療效[1]，所以尋找新的低毒抗腫瘤藥物是臨床迫切的需要。竹節(jié)香附素A(raddeanin A,RA)是從竹節(jié)香附(又名銀蓮花，兩頭尖)中分離出的一種三萜皂苷,《醫(yī)方歌括》最早記載了兩頭尖可治療乳腺癌。現(xiàn)代藥理研究已證實(shí)RA具有明顯的抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗驚厥、鎮(zhèn)靜等作用[2-7]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)RA能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，并能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬和凋亡[8-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討RA能否抑制HCT116細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡,并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及細(xì)胞株 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含雙抗)及胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hycolon公司；RA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)：141113)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：M2128)；Annexin- V/PI凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司(批號(hào)：556547)；雷帕霉素(RAPA)、β-actin、Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Bcl-2、Bax、caspsae-3、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)、RAPA靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)一抗及二抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116由上海生物研究所提供。

1.1.2儀器 AC2-4S1超潔凈工作臺(tái)、Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱、ELx800 酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Jena公司；JEOL-1010型透射電鏡(TEM)購(gòu)自日本JEOL公司；C6型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；Mini P-4 型垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞株培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃，含5%CO2、完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腸癌HCT116細(xì)胞，以8 000個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別每孔100 μL的完全培養(yǎng)液、1‰二甲亞砜(DMSO)、不同濃度的RA(1、2、4、8、16 μmol/L)培養(yǎng)不同的時(shí)間(12、24、36、48 h)，每孔加入MTT 溶液20 μL(5 mg/mL)。繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩5～10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度(OD)。重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算抑制率：

抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%

1.2.3TEM實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后加入含RA(4 μmol/L)的完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)12 h，消化收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定液固定后制片，然后進(jìn)行TEM觀察。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)(FCM)實(shí)驗(yàn) HCT116細(xì)胞種植于6孔板中培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的RA(2、4、8 μmol/L),繼續(xù)孵育12 h。收集各組細(xì)胞，PBS沖洗后重懸于500 μL Binding Buffer中，分別加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，避光振蕩10 min后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞種植于6孔板中，僅選擇RA 4、8 μmol/L 兩個(gè)濃度，大體觀察RA對(duì)自噬與凋亡相關(guān)蛋白趨勢(shì)變化的影響。收集細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法測(cè)定各樣本蛋白水平。每組取20 μg上樣，分別用12%、10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。后5%牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜緩沖液(TBST)洗膜3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后使用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行條帶分析，β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1RA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 RA能夠明顯抑制HCT116細(xì)胞增殖。不同濃度的RA(1、2、4、8、16 μmol/L)作用于HCT116細(xì)胞不同的時(shí)間(12、24、36、48 h)，其抑制率隨著濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而增大，RA對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴性(圖1)。當(dāng)RA 1 μmol/L作用于HCT116細(xì)胞12 h時(shí)，其抑制率為(39.08±2.30)%，作用48 h時(shí)抑制率為(67.84±0.23)%，當(dāng)RA 16 μmol/L作用48 h時(shí)抑制率為(90.10±1.21)%，各實(shí)驗(yàn)組抑制率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而溶劑對(duì)照組抑制率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鏡下觀察，隨著RA給藥濃度的增大，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間的空隙逐漸增大、數(shù)量逐漸減少，形態(tài)也由原來(lái)的多觸角逐漸變圓，細(xì)胞活力下降，逐漸趨于死亡，見(jiàn)圖2。

a:P<0.05,與對(duì)照組比較

圖1 RA對(duì)腸癌HCT116細(xì)胞增殖抑制的影響

A:對(duì)照組；B:RA 2 μmol/L；C：RA 4 μmol/L；D：RA 8 μmol/L

圖2 MTT觀察各組腸癌HCT116細(xì)胞形態(tài)(×200)

A：TEM(×2 900,箭頭處為自噬體)；B：TEM(×18 500,箭頭處為自噬體)；C：各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 RA對(duì)HCT116細(xì)胞自噬及自噬相關(guān)蛋白的影響

圖4 FCM檢測(cè)各組腸癌HCT116細(xì)胞凋亡情況

2.2RA對(duì)HCT116細(xì)胞自噬的影響 TEM結(jié)果顯示，RA作用于細(xì)胞12 h后，在電鏡下(>3個(gè)視野)可觀察到雙層膜自噬體(圖3A、B)，而對(duì)照組中未找到自噬體。Western blot結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，Beclin-1蛋白表達(dá)逐漸增加，LC3Ⅰ蛋白逐漸減少，而LC3Ⅱ逐漸增加(圖3C)。LC3分別以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式存在，LC3Ⅰ在胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)泛素化與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成LC3Ⅱ，定位于自噬體膜上，是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體的增多而增多，LC3Ⅱ的水平或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)。

2.3RA對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響 FCM結(jié)果顯示，當(dāng)RA 2 μmol/L作用于細(xì)胞時(shí)，早期凋亡率為(10.30±1.25)%，晚期凋亡率為(2.30±0.87)%；當(dāng)RA 8 μmol/L作用于細(xì)胞時(shí)，早期凋亡率增加至(26.80±2.03)%，晚期凋亡率增加至(10.80±1.03)%(圖4)。Western blot結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2逐漸遞減，而促凋亡蛋白Bax逐漸增加，凋亡標(biāo)志性蛋白Caspase-3、PARP被剪切成Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP，見(jiàn)圖5。

圖5 各組腸癌HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4mTOR通路對(duì)RA誘導(dǎo)的自噬及凋亡的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，mTOR蛋白表達(dá)增加，而p-mTOR蛋白表達(dá)遞減(圖6A)。使用mTOR通路抑制劑RAPA(100 nmol/L)后，自噬相關(guān)蛋白Becin-1、LC3表達(dá)增加，凋亡率增加，凋亡標(biāo)志性蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP也增加，見(jiàn)圖6B、C。

A：各組細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)；B：FCM檢測(cè)各組HCT116細(xì)胞自噬情況；C：各組HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖6 mTOR通路對(duì)RA誘導(dǎo)的自噬及凋亡的影響

3 討 論

近年來(lái)關(guān)于自噬的研究已經(jīng)成為熱門，OHSUMI[10]也因闡述了自噬的機(jī)制而榮獲2016年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，自噬調(diào)控機(jī)制的失調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的聯(lián)系，一方面，自噬通過(guò)參與清理受損的線粒體和過(guò)氧化物酶體，促進(jìn)細(xì)胞分化，和(或)增加自噬性死亡發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，腫瘤細(xì)胞通過(guò)自噬不斷適應(yīng)變化的生長(zhǎng)條件，使侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的腫瘤細(xì)胞有效逃脫凋亡的威脅，在各種惡劣環(huán)境下得以存活[11]。

細(xì)胞發(fā)生凋亡通?？梢苑譃?個(gè)階段:(1)啟動(dòng)階段，由各種誘因進(jìn)入細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序；(2)效應(yīng)階段，通過(guò)調(diào)節(jié)促凋亡因子與抗凋亡因子來(lái)決定是否發(fā)生凋亡；(3)執(zhí)行階段，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡所特有的形態(tài)學(xué)特征和生化特點(diǎn)：DNA斷裂、核固縮、核碎裂、核溶解,以凋亡小體形成和Caspase激活為特征,最后被吞噬細(xì)胞的溶酶體降解[12]。

自噬與凋亡同屬于程序性細(xì)胞死亡，為主動(dòng)死亡，但在形態(tài)、分子機(jī)制、生化指標(biāo)方面均存在不同，有研究發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)大量自噬小體的細(xì)胞,用Caspase抑制劑不能阻止細(xì)胞死亡,而利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤卻能阻止細(xì)胞死亡,說(shuō)明自噬性死亡不同于凋亡[13]。自噬與凋亡雖然是兩個(gè)不同的過(guò)程,但越來(lái)越多的研究提示，二者確實(shí)存在一些共同的調(diào)節(jié)因子,如Bcl-2，Beclin-1。Bcl-2等抑凋亡因子可以通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Beclin-1結(jié)合而影響其活性，而B(niǎo)eclin-1又是調(diào)節(jié)自噬的重要靶點(diǎn)，因而B(niǎo)cl-2等凋亡因子又可進(jìn)一步影響自噬[14]。YEE等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PUMA和Bax誘導(dǎo)的自噬，可使損傷的線粒體被選擇性的清除，減少凋亡的應(yīng)答。

本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，RA在低濃度(1 μmol/L)就表現(xiàn)出對(duì)腸癌細(xì)胞HCT116增殖抑制作用,且這種抑制作用隨濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步加強(qiáng),即呈劑量-時(shí)間相關(guān)(圖1)。鑒于RA能夠明顯抑制腸癌細(xì)胞增殖，本研究推測(cè)RA能否誘導(dǎo)自噬和凋亡。為此，采用不同濃度的RA作用于HCT116細(xì)胞，在TEM觀察到雙層膜自噬體的產(chǎn)生(圖3A、B)，Western blot也證實(shí)Becin-1、LC3蛋白表達(dá)增加(圖3C)，說(shuō)明RA能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞自噬。FCM結(jié)果顯示隨著RA濃度的增大，細(xì)胞凋亡率逐漸增高(圖4)；Western blot結(jié)果也證實(shí)凋亡標(biāo)志性蛋白Cleaved-caspase-3、Ceaved-PARP表達(dá)增高(圖5)，提示RA能劑量依賴性地誘導(dǎo)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡。

本研究證實(shí)了RA能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞自噬和凋亡，猜想RA是通過(guò)調(diào)控某條信號(hào)通路，來(lái)實(shí)現(xiàn)以上抗腫瘤藥效。而關(guān)于自噬和凋亡的調(diào)控，關(guān)注較多的是mTOR信號(hào)通路。mTOR作為磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinases，PIKK)家族成員的一員，是一種進(jìn)化保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT),作為AKT通路的下游效應(yīng)分子，以及作為氨基酸、三磷酸腺苷酸和激素的感受器，與腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、蛋白合成、細(xì)胞自噬等密切相關(guān)[16]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌中都有mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異常[17]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA作用于細(xì)胞后，mTOR蛋白表達(dá)增多，而p-mTOR蛋白表達(dá)減少(圖6A)。而當(dāng)使用了mTOR通路抑制劑RAPA后，自噬相關(guān)蛋白Becin-1、LC3表達(dá)增加。細(xì)胞凋亡率較RA、RAPA單獨(dú)給藥組也增加，且凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表達(dá)也增加(圖6B、C)，說(shuō)明RA誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞自噬和凋亡可能是通過(guò)調(diào)控mTOR通路實(shí)現(xiàn)的。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為RA可明顯抑制人腸癌HCT116細(xì)胞株的增殖，且與濃度、時(shí)間呈正相關(guān)；而調(diào)控mTOR信號(hào)通路，可能是RA發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡藥理作用潛在的分子機(jī)制。結(jié)合前期相關(guān)研究結(jié)果，可以推測(cè)RA可能是一個(gè)潛在的有效的抗腫瘤藥物，而目前研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，期待更進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)獲取更多更高級(jí)別的證據(jù)支持。

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