TRPM7在七氟烷預處理抑制大鼠氧糖剝奪海馬神經元凋亡和炎癥反應中的作用*

鞏紅巖，鄭 芳，左志超，劉景景，王慶志，趙國安△

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院：1.麻醉科；2.超聲科；3.心臟研究中心，河南新鄉 453000)

近年來大量研究表明，吸入麻醉藥預處理具有明顯的腦保護作用，尤其是七氟烷(sevoflurane,Sev)[1-3]。腦缺血動物模型中，Sev預處理可明顯減少缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)造成的細胞凋亡和神經炎癥反應[1-3]。然而，Sev預處理作用的具體機制尚不明確。鈣穩態失衡在腦缺血后神經元凋亡和興奮性細胞毒性中發揮重要作用[4]。而近期研究表明，腦IRI后瞬時受體電位通道M7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)可過度表達并通過誘發Ca2+過度內流加重神經元損傷或凋亡[5-7]。因此，TRPM7已成為治療腦缺血性損傷的重要靶點[7-8]。但Sev預處理是否通過緩解TRPM7過度表達發揮腦保護作用尚不清楚。本實驗通過建立原代大鼠海馬神經元氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)模型，探討TRPM7在Sev預處理后抑制大鼠OGD海馬神經元凋亡和炎癥反應中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動物：選擇出生1 d內的新生SD大鼠50只，體質量50 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。(2)主要儀器與試劑：Sev(批號：10013131)購自江蘇恒瑞醫藥有限公司；高糖培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養基、無糖DMEM培養基、B27、馬血清購自美國Gbico公司；緩激肽(批號：90834)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，批號：M2128)購自美國Sigma 公司；原位缺口末端標記(TUNEL)試劑盒(批號：AKP1684817)購自瑞士Roche公司；白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(批號分別為EK0398、EK0527)購自武漢博士德生物有限公司；反轉錄試劑盒(批號：DRR047A)購自日本TakaRa公司；抗TRPM7抗體(批號：ab109438)購自美國Abcam公司；抗β-actin抗體(批號：BM0627)購自武漢博士德生物有限公司；熒光顯微鏡(型號：DM2500)購自美國 Leica公司；酶標儀、凝膠成像系統購自美國Bio Rad公司。

1.2方法

1.2.1大鼠海馬神經元培養 參照文獻[9-11]方法，提取大鼠海馬神經元。75%乙醇消毒后斷頭處死大鼠，于冰上仔細分離海馬組織，將海馬組織剪成約1 mm3的小塊后加入0.125%胰蛋白酶 37 ℃消化5 min，再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基洗終止胰酶消化。離心6 min(1 000 r/min)后，棄去上清液，重懸細胞并進行細胞計數，以6.5×105個/孔或1×105個/孔的細胞密度分別接種到多聚賴氨酸包被的6孔板或96孔板中，6孔板培養板中提前置入蓋玻片。細胞培養基為含2%B27、5%馬血清、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素的高糖DMEM培養基。細胞在37 ℃、5%CO2-95%空氣的濕潤培養箱中培養，觀察并記錄每天細胞生長狀態，每2～3天行半量換液，并于培養3 d時向培養基中加入終濃度為10 mmol/L阿糖胞苷以抑制非神經元細胞的生長。

1.2.2OGD模型的建立 參照文獻[9,12]方法，建立海馬神經元OGD模型。神經元培養10 d后，將細胞培養基換為無糖DMEM培養基。再將培養板置于培養箱中，以5～10 L/min的流速向缺氧培養箱內吹入含95%N2和5%CO2的混合氣體，1.5 h后將培養板取出并換回原來高糖DMEM培養基，于原培養箱培養24 h。

1.2.3Sev預處理 參照文獻[2,10]方法，Sev預處理24 h后建立OGD模型。將培養的神經元放入培養箱中，麻醉機與培養箱連接后，Sev揮發罐刻度開到2%，用含5%CO2的空氣(流速2 L/min)將Sev送入培養箱，1 h后關閉揮發罐，繼續通入空氣洗脫Sev，30 min后放回原培養箱培養，培養24 h。

1.2.4實驗分組 將神經元細胞隨機分為5組，包括對照組、Sev預處理組(Sev組)、OGD組、Sev預處理+OGD組(Sev+OGD組)和Sev預處理+緩激肽+OGD(聯合組)。對照組海馬神經元僅做正常培養；Sev組海馬神經元行2%Sev預處理；OGD組海馬神經元僅制備OGD模型；Sev+OGD組神經元行2%Sev預處理后制備OGD模型；聯合組神經元Sev預處理同時在培養基中加入緩激肽(TRPM7特異性激動劑，終濃度200 μmol/L)[13]，其余處理同Sev+OGD組。

1.2.5MTT法檢測 將96孔板中培養的神經元，各組隨機取10孔，于正常培養24 h后使用MTT比色法檢測神經元存活率。每孔中加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，于37 ℃、含5%CO2-95%空氣的濕潤培養箱中反應4 h。倒出反應液體后，每孔中加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，反應10 min至藍紫色結晶完全溶解，用酶標儀在570 nm 波長測得吸光度(OD570 nm)值，計算神經元相對存活率[14]：

存活率=(實驗組OD570/對照組OD570)×100%

(1)

1.2.6TUNEL凋亡染色法 參照文獻[12]方法，將6孔板中各組培養的神經元，隨機取5孔，采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的TUNEL法檢測神經元凋亡。室溫下4%多聚甲醛固定神經元30 min后，加新鮮配制的破膜液(含0.2%TritonX-100)處理3 min。按廠家操作說明配制TUNEL反應液(TdT酶∶FITC熒光標記溶液為1∶9)，每孔加入反應混合液40～50 μL，并于37 ℃的暗箱內孵育l h。使用含二脒基苯基吲哚(DAPI)水溶性封片劑封片。熒光顯微鏡下每個樣本隨機選5個視野(×400)， DAPI染色細胞核發藍色熒光，TUNEL染色凋亡細胞發綠色熒光，計算神經元凋亡率：

凋亡率=(陽性凋亡細胞/細胞總數)×100%

(2)

1.2.7Western blot檢測 正常培養24 h后，將6孔板中培養的神經元，各組隨機取6孔，使用Western blot法檢測神經元TRPM7的表達水平。各組細胞培養板中加入裂解液，細胞刮刮下細胞，裂解產物用BCA試劑盒進行蛋白定量。加入5 ×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水中煮8～10 min后自然冷卻，然后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜在含2%胎牛血清封閉液中室溫封閉1 h后，浸于稀釋的一抗(抗TRPM7抗體，1∶1 000；抗β-actin抗體，1∶500)中4 ℃孵育過夜。第2天，TBST液洗滌5 min×3次后，浸于稀釋的相應生物二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST液洗滌5 min ×3次后行增強化學發光法(ECL)顯色，在凝膠成像系統中成像，并用Image Lab 3.0軟件進行灰度分析。

1.2.8實時定量PCR(RT-PCR)檢測 參照文獻[15]方法，將6孔板中培養的神經元，各組隨機取6孔，采用RT-PCR法進行測定TRPM7的mRNA表達水平，PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。棄去培養液后，各孔中加入Trizol反復吹打，以保證細胞充分裂解。之后，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，取產物5 μL參照Takara公司試劑盒說明書進行RT-PCR操作。TRPM7上游引物：5′-GCA AAT GAC TCC ACT CTC-3′；下游引物：5′-GAT TCT CTC TCA CTC CCA G-3′，擴增片段長度422 bp[16]。IL-1β上游引物：5′-GTG GGG ATG ATG ACG ACC-3′；下游引物：5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GG-3′，擴增片段長度241 bp[15]。TNF-α上游引物：5′-AAC TGG CAG AGG AGG CG-3′；下游引物：5′-CAG AAG AGC GTG GTG GC-3′，擴增片段長度為115 bp[15]。β-actin上游引物：5′- GAC GAT ATC GCT GCG CTG-3′；下游引物：5′-GTA CGA CCA GAG GCA TAC AGG-3′，擴增片段長度 348 bp[17]。采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行PCR反應，反應體系為10 μL。反應擴增條件為：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性8 s，65 ℃退火，65 ℃延伸30 s，40個循環。參照文獻[18]的方法，獲得TRPM7、IL-1β、TNF-α與β-actin mRNA的CT值，以實驗組目的基因相對于對照組的表達量即2-ΔΔCt[-ΔΔCT=-(ΔCT實驗組-ΔCT對照組)；ΔCT=CT目的基因-CTβ-actin]反映其表達水平。

1.2.9ELISA法測定神經元IL-1β和TNF-α釋放水平 正常培養24 h后，將96孔板中培養的神經元，各組隨機取6孔，收集神經元培養上清液，采用ELISA法測定IL-1β和TNF-α釋放水平。根據廠家說明書，在新的96孔板中分別加入各組神經元培養上清或不同濃度標準品。先后加入生物素化抗體工作液、酶結合工作液及顯色劑。加入終止液之后輕輕震蕩，即可測量OD450 nm。根據標準品的OD分別繪制標準曲線后，計算各個樣本上清液中IL-1β及TNF-α的蛋白水平。

2 結 果

2.1各組大鼠海馬神經元TRPM7 mRNA和蛋白表達水平比較 與對照組比較，OGD組海馬神經元TRPM7 mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與OGD組比較，Sev組海馬神經元TRPM7 mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與Sev組比較，聯合組海馬神經元TRPM7 mRNA及蛋白表達水平較高(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組海馬神經元TRPM7 mRNA和蛋白表達水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與OGD組比較；c：P<0.05，與Sev+OGD組比較

1：對照組；2：Sev組；3：OGD組；4：Sev+OGD組；5：聯合組。

圖1各組大鼠海馬神經元TRPM7蛋白表達水平

2.2各組大鼠海馬神經元存活及凋亡率比較 與對照組比較，OGD組海馬神經元存活率明顯降低，而凋亡率明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與OGD組比較，Sev組海馬神經元存活率較高，而凋亡率明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與Sev組比較，聯合組海馬神經元存活率明顯降低，而凋亡率明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

2.3各組大鼠海馬神經元IL-1β、TNF-α mRNA及上清蛋白表達水平的比較 與對照組比較，OGD組海馬神經元IL-1β、TNF-α mRNA及上清蛋白表達水平均增高(P<0.05)。與OGD組比較，Sev組海馬神經元IL-1β、TNF-α mRNA及上清蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。與Sev組比較，聯合組海馬神經元IL-1β、TNF-α mRNA及上清蛋白表達水平均較高(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠海馬神經元存活及凋亡率比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與OGD組比較；c：P<0.05，與Sev+OGD組比較

A：對照組；B：Sev組；C：OGD組；D：Sev+OGD組；E：聯合組。

圖2各組海馬神經元TUNEL陽性凋亡細胞顯示(白色箭頭所指，×400)

表3 各組大鼠海馬神經元IL-1β、TNF-α mRNA及上清蛋白表達水平的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與OGD組比較；c：P<0.05，與Sev+OGD組比較

3 討 論

本實驗研究結果表明，Sev預處理可緩解OGD后海馬神經元TRPM7過度表達，并減輕凋亡和炎癥因子釋放。而TRPM7特異性激動劑緩激肽可逆轉Sev預處理的抗炎及抗凋亡作用，說明Sev預處理的保護作用可能與抑制OGD后海馬神經元TRPM7的過度表達相關。

Sev預是臨床上常用的吸入麻醉藥，具有起效快、蘇醒快等優點，且其腦保護也得到了廣泛關注[1-2,19-20]。大鼠中Sev的最低肺泡有效濃度(MAC)為2%[21]，1 MAC Sev預處理1 h已在體外腦和心肌IRI模型中應用[20-21]。而海馬組織對于缺血缺氧最為敏感。因此，本研究于OGD模型建立前24 h，使用2%Sev處理海馬神經元1 h，作為Sev預處理的實驗方法。

TRPM7是一種廣泛表達于中樞神經系統的離子通道蛋白，在海馬神經元有十分重要的功能調節作用[7]。在缺血缺氧狀態下， 氧自由基可通過激活或上調海馬神經元TRPM7介導過度的神經元Ca2+內流，進而導致細胞毒性和細胞凋亡[7,22]。 本研究結果表明，OGD模型后海馬神經元TRPM7 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，且細胞凋亡明顯增多，細胞存活率明顯降低。而Sev預處理不僅可緩解OGD后的神經元凋亡，亦可下調TRPM7 mRNA和蛋白表達水平。說明OGD后Sev預處理的神經元保護作用，可能與其下調TRPM7的效果相關。而進一步實驗證實，TRPM7的特異性激動劑緩激肽可逆轉Sev預處理的抗凋亡和神經元保護作用，說明Sev預處理可通過減少OGD后海馬神經元TRPM7的過度表達，發揮抗凋亡和神經元保護作用。

抗炎作用亦是Sev預處理腦保護作用的重要機制[2]。本研究結果表明，OGD可誘發海馬神經元IL-1β和TNF-α等促炎因子mRNA和上清蛋白表達水平明顯升高，而Sev預處理可緩解OGD誘發的IL-1β和TNF-α釋放。而TRPM7的特異性激動劑緩激肽可逆轉Sev的這種抗炎作用，說明Sev預處理可通過減少OGD后海馬神經元TRPM7的過度表達發揮其抗炎作用。

綜上所述，Sev預處理可通過緩解神經元TRPM7過度表達，減輕OGD后海馬神經元凋亡和炎癥反應。

[1]CANAS P T,VELLY L J,LABRANDE C N,et al.Sevoflurane protects rat mixed cerebrocortical neuronal-glial cell cultures against transient oxygen-glucose deprivation - Involvement of glutamate uptake and reactive oxygen species[J].Anesthesiology,2006,105(5):990-998.

[2]WANG H,LU S,YU Q,et al.Sevoflurane preconditioning confers neuroprotection via anti-inflammatory effects[J].Front Biosci(Elite Ed),2011,3(2):604-615.

[3]SIGAUT S,JANNIER V,ROUELLE D,et al.The preconditioning effect of sevoflurane on the Oxygen glucose-deprived hippocampal slice:the role of tyrosine kinases and duration of ischemia[J].Anesth Analg,2009,108(2):601-608.

[4]SZYDLOWSKA K,TYMIANSKI M C.Ischemia and excitotoxicity[J].Cell Calcium,2010,47(2):122-129.

[5]JIANG H,TIAN S L,ZENG Y,et al.TrkA pathway(s) is involved in regulation of TRPM7 expression in hippocampal neurons subjected to ischemic-reperfusion and oxygen-glucose deprivation[J].Brain Res Bull,2008,76(1/2):124-130.

[6]CLAPHAM D E.TRP channels as cellular sensors[J].Nature,2003,426(6966):517-524.

[7]AARTS M M,TYMIANSKI M.TRPM7 and ischemic CNS injury[J].Neuroscientist,2005,11(2):116-123.

[8]BAE CY,SUN H S.TRPM7 in cerebral ischemia and potential target for drug development in stroke[J].Acta Pharmacol Sin,2011,32(6):725-733.

[9]GE Q F,HU X,MA Z Q,et al.Baicalin attenuates oxygen-glucose deprivation-induced injury via inhibiting NMDA receptor-mediated 5-lipoxygenase activation in rat cortical neurons[J].Pharmacol Res,2007,55(2):148-157.

[10]邵建林，萬曉紅，王雁，等．HO-1在七氟烷預處理抑制大鼠氧糖剝奪海馬神經元凋亡中的作用[J]．中華麻醉學雜志，2010，30(4)：484-487．

[11]邵建林，萬曉紅，曾衛軍，等．血紅素加氧酶-1對氧糖剝奪海馬神經元CDK5-ATM-P53信號轉導通路的影響[J]．中華麻醉學雜志，2012，32(6)：732-735．

[12]LIU D,ZHANG H,GU W J,et al.Neuroprotective effects of ginsenoside Rb1 on high Glucose-Induced neurotoxicity in primary cultured rat hippocampal neurons[J].PLoS One,2013,8(11):e79399.

[13]DOU Y L,LI Y,CHEN J K,et al.Inhibition of cancer cell proliferation by midazolam by targeting transient receptor potential melastatin 7[J].Oncol Lett,2013,5(3):1010-1016.

[14]MAGIERA M M,MORA S,MOJSA B,et al.Trim17-mediated ubiquitination and degradation of Mcl-1 initiate apoptosis in neurons[J].Cell Death Differ,2013,20(2):281-292.

[15]施慶余，羅愛林，李世勇．異氟烷對發育期大鼠海馬 IL-1β mRNA,IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 表達的影響[J]．中華麻醉學雜志，2010，30(3)：324-326．

[16]TOUYZ R M,HE Y,MONTEZANO A C,et al.Differential regulation of transient receptor potential melastatin 6 and 7 cation channels by ANG II in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2006,290(1):73-78.

[17]HIROSE K,OKAJIMA K,TAOKA Y,et al.Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation[J].Ann Surg,2000,232(2):272-280.

[18]LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[19]KITANO H,KIRSCH J R,HURN P D,et al.Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain[J].J Cerebral Blood Flow Metabol,2007,27(6):1108-1128.

[20]WANG J K,YU L N,ZHANG F J,et al.Postconditioning with sevoflurane protects against focal cerebral ischemia and reperfusion injury via PI3K/Akt pathway[J].Brain Res,2010,1357(1):142-151.

[21]OBAL D,DETTWILER S,FAVOCCIA C,et al.The influence of mitochondrial K-ATP-channels in the cardioprotection of preconditioning and postconditioning by sevoflurane in the rat in vivo[J].Anesth Analg,2005,101(5):1252-1260.

[22]SUN H S,JACKSON M F,MARTIN L J,et al.Suppression of hippocampal TRPM7 protein prevents delayed neuronal death in brain ischemia[J].Nat Neurosci,2009,12(10):1300-1307.