FBP1在腎透明細胞癌組織中的表達變化及意義*

洪正東，朱安義，王艷華，史子敏，胡映波

(南昌大學第二附屬醫院泌尿外科，南昌 330006)

腎癌又稱腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)，主要起源于腎小管上皮細胞，是最常見的泌尿系統致死性腫瘤之一，近年在世界各國均有發病率上升的趨勢。果糖1,6二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase，FBP1)位于染色體9q22位上，廣泛存在于人體多種組織和器官中 ，該基因的低表達或缺失與許多腫瘤密切相關，如胰腺癌[1]、肺癌[2-3]、乳腺癌[4]等。它能抑制有氧糖酵解和腫瘤進展，其低表達常提示腫瘤預后差 ，是目前研究比較熱的抑癌基因，但其在腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)組織內的表達國內尚少見文獻報道。為此，本研究采用臨床組織標本，應用Western blot和逆轉轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法觀察FBP1在腎癌及癌旁組織中的表達情況，以期為臨床上探討FBP1蛋白在腎癌發生、發展中的作用及其表達水平的調控研究提供有益線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取南昌大學第二附屬醫院和南昌大學第一附屬醫院2001年1月至2010年9月118例病理診斷為RCCC患者的石蠟切片，收集南昌大學第二附屬醫院2014年1月至2015年6月40例RCCC患者的新鮮標本，所有患者均已行手術治療，術后按照指南要求標準化隨訪，所有試驗均得到南昌大學第二附屬醫院和第一附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1標本收集方法 在腎癌及其癌旁組織被切除離體后的15 min內對標本進行大體觀察、測量，確認腫瘤的部位與范圍；事先準備幾只裝有RNA保護液的滅菌EP管，然后將癌及癌旁(陰性切緣)組織切取直徑約2～5 mm的組織塊3～4塊迅速放入這些EP管中并迅速將該管置于液氮罐內，2 h內將液氮罐內的標本轉移至-86 ℃的深低溫冰箱中長期保存留作試驗用。癌與癌旁的界定方法：根據泌尿外科診療指南要求只要位于腫瘤包膜外的即是癌旁正常組織，結合文獻本研究在收集標本時統一于癌旁0.5 cm以外處切取組織作為癌旁正常組織。

1.2.2隨訪內容及方法 常規隨訪內容包括：(1)病史詢問；(2)體格檢查；(3)血常規和血生化檢查，如果堿性磷酸酶(ALP)異常升高或(和)有骨轉移癥狀如骨痛，需要進行骨掃描檢查；(4)X線檢查，首選胸部CT掃描檢查，或正、側位胸片；(5)腹部超聲波檢查，腹部超聲波檢查異常的患者、NSS及T3～4期RCCC手術后患者需要行腹部CT檢查，可每6個月1次，以后視具體情況而定。對于T1～2期患者：每3～6個月隨訪1次，連續3年，以后每年隨訪1次；T3期患者：每2個月隨訪1次,連續2年，第3年每6個月隨訪1次，以后每年隨訪1次。

1.2.3免疫組織化學法 FBP1鼠抗人單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，免疫組織化學法試劑盒購自北京中杉金橋公司，按照試劑盒說明進行操作。檢測對象均為新鮮的RCCC及癌旁組織標本，標本大小為0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm。

1.2.4Western blot檢測 將新鮮標本剪成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小，再將其制備組織裂解液，取50 μg總蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(100 V,80 min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗FBP1抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)分別4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；用紅外熒光染料標記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，Odyssey掃描成像。

1.2.5RT-PCR檢測 將新鮮標本組織剪成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm左右大小，應用Trizol法抽提組織中總RNA，cDNA合成實驗根據BIO-RAD公司cDNA synthesis Kit實驗步驟進行。FBP1引物序列，上游：5′-ATG TTG GAA GAT CCA TCA AGG-3′，下游5′-AAC ATG TTC ATA ACC AGG TCG-3′；β-actin引物序列，上游：5′-GTA CCA CAG GCA TTG TGA TGG ACT-3′，下游：5′-CTT TGA TGT CAC CCA CGA TTT CCC-3′。PCR反應體系為20 μL，反應條件為94 ℃，預孵育10 min，然后94 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

2 結 果

2.1RCCC及癌旁組織中FBP1蛋白表達水平比較 118例RCCC及其癌旁組織的配對標本，通過免疫組織化學染色觀察標本FBP1蛋白的表達情況，78.81%(93/118)的癌旁組織中可見FBP1蛋白呈強陽性表達，僅39.83%(47/118)的RCCC癌組織中FBP1蛋白表達陽性，二者比較差異有統計學意義(P<0.01)。RCCC及癌旁組織中FBP1蛋白表達水平，見圖1。

2.2FBP1低表達與RCCC患者臨床病理特點及預后的關系 根據FBP1的表達情況將118例RCCC患者分為47例FBP1高表達組和71例FBP1低表達組。分析FBP1的表達和腎癌患者病理特點之間的關系，發現FBP1低表達與患者臨床分期、病理分級、危險系數及是否復發明顯相關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、癥狀及腫瘤大小，部位，是否有壞死，是否有血管侵犯和腎上腺是否有累及無關(P>0.05)，見表1。FBP1高表達的腎癌患者的5年生存率高于FBP1低表達者(P<0.05)，見圖2。

A：癌組織(SP×200)；B：癌組織(SP×400)；C：癌旁組織(SP×200)；D：癌旁組織(SP×400)

圖1免疫組織化學方法檢測RCCC及癌旁組織中FBP1的表達

表1 118例RCCC患者中FBP1的表達與臨床病理特征間關系

續表1 118例RCCC患者中FBP1的表達與臨床病理特征間關系

2.3RCCC癌組織和癌旁組織中FBP1蛋白的表達水平比較 用相同的40例RCCC及其癌旁組織的配對標本，采用Western blot法進一步驗證FBP1蛋白的表達變化情況。結果顯示40份RCCC癌組織中FBP1的陽性表達率較其相應癌旁組織明顯下降，差異有統計學意義(t=8.665，P<0.01)，見圖3。

T：癌組織；N：癌旁組織；a：P<0.01，與癌旁組織比較

圖3 FBP1蛋白在RCCC癌組織及癌旁組織中的表達

2.4RCCC癌組織和癌旁組織中FBP1 mRNA的表達水平比較 應用RT-PCR方法，檢測40例新鮮RCCC癌組織及其癌旁組織的配對標本中FBP1mRNA的表達變化。結果顯示，31份標本的癌旁組織中FBP1mRNA均有明顯的表達，而僅9份癌組織中FBP1mRNA表達陽性(t=2.908，P=0.044)，RCCC癌組織中FBP1mRNA的表達水平明顯降低，見圖4。

N:癌旁組織；T:癌組織；a：P<0.05，與癌旁組織比較

圖4 FBP1 mRNA在RCCC癌組織及癌旁組織中的表達

3 討 論

腎癌在泌尿系統腫瘤中居第2位，在全身所有腫瘤中大約占2%，85%左右為RCCC[5-6]。腎癌的發病機制十分復雜，是一個多基因、多信號、多因素共同作用的過程，國內的流行病學檢查結果顯示腎癌的發病率在不斷的升高[7]。

近年來，FBP1與腫瘤的關系受到越來越多的關注。在胰腺癌組織中，核仁磷酸蛋白(NPMI)通過抑制FBPI的表達來促進有氧糖酵解和腫瘤進展，FBP1的表達缺失提示胰腺癌患者預后差[1]。SHENG等[2]通過檢測了140例肺癌、癌旁及正常肺組織發現肺癌組織中FBP1的表達明顯低于癌旁及正常肺組織，較高表達FBP1肺癌患者的生存期和總體生存率明顯高于FBP1低表達的肺癌人群。本研究結果顯示，FBP1蛋白在腎癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，呈現明顯異常低表達，提示FBP1蛋白功能缺失可能與腎癌的發生、發展密切相關，這也與LI等[8]的研究結果一致，而且本研究還進一步分析了FBP1與RCCC患者臨床、病理等之間的關系。LI等[8]在研究FBP1與RCCC的關系時發現FBP1主要通過兩種不同的機制來抑制腎癌的進展。(1)FBP1作為糖酵解中的關鍵酶，對抗腎小管上皮細胞中的糖酵解流量[9]，從而抑制透明細胞癌生成的潛在瓦勃效應[10-11]。(2)在VHL缺乏的RCCC中，FBP1通過直接結合缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的轉錄抑制去抑制HIF-1α的功能，從而達到其抑制細胞增殖、糖酵解和糖磷酸途徑[12]，這些都是以非催化作用依賴方式進行的 。

本研究結果顯示，腎癌組織與癌旁組織比較，FBP1不僅在蛋白質水平表達明顯降低，而且mRNA水平表達也明顯降低，且差異均有統計學意義(P<0.05)。而且FBP1低表達與患者臨床分期、病理分級、危險系數及是否復發呈明顯陽性關系，FBP1表達陽性的腎癌患者，其5年生存率明顯高于FBP1表達陰性的患者。這些結果說明了FBP1與腎癌密切相關，伴隨著腎癌的發生，FBP1基因表達在轉錄水平受到了抑制，具體作用機制需要更廣泛而深入的研究。如果找到了腎癌發生中調控FBP1基因表達的調節因子，就能夠為研發干預治療藥物提供理論指導，并且這一發現將具有重要的潛在臨床意義。

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