微孔板變色硅膠顯色法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性*

陳俊林，黃 飛，顧德林△，瞿 梅，胡忠義，丁元生

(1.江蘇省南通市第六人民醫院結核科 226011;2.同濟大學附屬上海市肺科醫院 200433; 3.上海積彩醫療器械有限公司 201508)

結核病是中國政府重點控制的三大傳染病之一,特別是耐藥結核分枝桿菌(MTB)的流行，已成為困擾公共衛生的最大問題[1-2]。其中耐利福平(RIF)的MTB尤其受到格外重視，這是因為RIF是現代結核病化療的一線最主要藥物，也是公認縮短結核病療程和提高治愈率的最關鍵藥物。如果能及早發現耐RIF的MTB，及時更改抗結核治療方案，將提高結核病治愈率、避免無效用藥和減少耐多藥MTB形成[3]。MTB藥物敏感性檢測金標準為羅氏培養及比例法藥敏，但因其需耗時間為4～8周，不能滿足實際需要。而目前一些MTB快速藥敏檢測技術如Bactec MGIT960、基因檢測技術、微量液體最低抑菌濃度(MIC)技術等存在設備和試劑昂貴或操作要求高，判讀結果易受到主觀影響[4-5]，不能推廣應用于基層實驗室。由本課題組研制一款MTB藥敏檢測新型實用產品——24孔微量液體培養硅膠顯色板，即將進行產業化。本實驗利用該新型產品除對MTB臨床分離株進行了RIF藥物敏感性測試，還嘗試對涂陽痰標本的RIF藥物敏感性進行了檢測，進一步縮短了報告時間，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 MTB標準菌株H37Rv(ATCC27294)和牛分枝桿菌(M.bovis ATCC 19210)購自國家菌種保藏中心，50株MTB臨床分離株來自江蘇省南通市第六人民醫院結核科2013 年5月至2015年1月住院肺結核患者的痰標本培養物，經菌種鑒定為MTB。40例涂陽痰標本來源于該院結核科2015年1月至2016年1月住院復治涂陽肺結核患者，痰抗酸桿菌菌量分級：按萎-尼染色鏡檢結果菌量分級標準以1+、2+、3+、4+記錄[6]。

1.1.2試劑與儀器設備 RIF購自美國Fluka公司；Bactec MGIT檢測儀、61010A-1型比濁儀，購自美國BD公司;GNP-92700隔水式培養箱，購自上海精宏實驗設備有限公司；對硝基苯甲酸(PNB)購自美國Sigma公司；24孔變色硅膠培養板，由上海積彩醫療器械有限公司提供；微孔板檢測儀購自東樂自然基因生命科學公司。

1.1.3試劑配置 液體培養基配制參見文獻[7]的方法，以7H9培養基為基礎液，輔以牛血清清蛋白，葡萄糖等，孔雀綠抑制非分枝桿菌微生物生長。藥物配制：RIF現用二甲基甲酰胺(DMF)溶解配制成10 mg/mL，再用液體培養基進行稀釋，終濃度為0.25～16 μg/mL；PNB用液體培養基稀釋至終濃度為800 μg/mL。

1.2方法

1.2.1微孔板變色硅膠顯色法檢測藥敏試驗

1.2.1.1微孔板變色硅膠顯色法檢測MTB臨床分離株對RIF的敏感性 將MTB臨床分離株于液體培養基培養2周后，用液體培養基重懸，磨菌5～10 min后靜置15 min，取上層均勻的懸濁液用液體培養基比濁至待用。取適量1.00 mg/mL的菌液按終濃度要求進行稀釋，使液體培養基中菌體的終濃度分別為10.00-1mg/mL、10.00-2mg/mL、10.00-3mg/mL和10.00-4mg/mL。24孔微孔板中設定陽性對照孔、陰性對照孔、測試孔。陽性對照孔加不含RIF培養基、接種不同濃度的菌液0.40 mL；陰性對照孔加不含RIF培養基、不接種菌，作為陰性控制；測試孔中加入0.40 mL不同濃度含RIF培養基，再分別接種不同濃度的菌液0.40 mL。用透明膠帶將培養板封好裝入一次性密封袋，置于37 ℃溫箱培養。從培養第2天起，每天觀察微孔板底硅膠顏色是否由天藍色逐漸變黃色，最多觀察21 d。實驗結果通過比較測試孔與陽性對照孔中菌株生長速度進行判斷。判斷方法是當陽性對照孔生長時，測試孔尚未生長，說明測試孔MTB生長被藥物抑制，判為敏感；而當測試孔MTB先于對照孔或與對照孔同時生長，說明藥物不能抑制測試菌株繁殖，判斷該測試孔對RIF耐受。結果判斷時間為5～15 d，超過21 d不生長需重復實驗。質量控制：每次實驗均以H37Rv為敏感株質控，以牛分枝桿菌為耐藥株質控，同一菌株的測試結果重復檢測3次。結果觀察：將24孔微孔板放置于自制的倒置放大鏡上[從倒置放大鏡中可以觀察微孔板底硅膠的顏色變化(空白板，圖1)；B1、C1、D1、B4微孔板底硅膠的顏色由天藍色逐漸變黃色，提示MTB生長(圖2)]或者通過微孔板檢測儀進行檢測，觀察并記錄結果。MIC定義為微孔板底含指示劑天藍色硅膠完全沒有發生顏色改變的最小藥物濃度。

圖1 24孔微孔板正置于放大鏡支架上

圖2 24孔板從放大鏡中觀察到的底部圖(測試后)

1.2.1.2微孔板變色硅膠顯色法檢測涂陽痰標本RIF敏感性 加設PNB含藥孔，將痰標本液化去污染處理后的沉淀，用液體培養基洗滌2遍，用5.00 mL液體培養基重懸。參照1.2.1.1流程向陽性對照孔、測試孔、PNB含藥孔各加入0.40 mL標本沉淀懸濁液，再進行培養觀察，最多觀察50 d。若對照孔內有細菌生長，PNB含藥孔無細菌生長，則說明該標本中為MTB；若對照孔內有細菌生長，PNB含藥孔有細菌生長，則說明標本中為非MTB。

1.2.2Bactec MGIT960培養及藥敏試驗

1.2.2.1MTB臨床分離株培養 經前處理后使用Bactec MGIT960 操作系統進行MTB液體培養，取陽性第3～5天培養管，無菌吸取1.00 mL陽性肉湯至4 mL無菌生理鹽水中，作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液 1∶100 稀釋作為對照菌液，分別以無菌方法加入500.00 μL對照菌液和稀釋菌液于Bactec MGIT960對照管和加有RIF的藥物培養管中顛倒混勻(培養基的藥物濃度為1.00 μg/mL)。放入Bactec MGIT960培養箱中，儀器會在15 d之內會自動報告敏感與耐藥結果。質量控制：每次藥敏試驗均采用H37Rv標準株作為陽性參照，以質控藥敏檢測結果。

1.2.2.2涂陽痰標本培養 取液化去污染后的標本懸液0.50 mL接種于Bactec MGIT960培養檢測管中，參照1.2.2.1流程進行培養及RIF藥敏檢測。

1.3統計學分析 使用SPSS13.0統計軟件分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。根據受試者工作特征(ROC)曲線分析，使用Medcale軟件計算RIF區分耐藥和敏感菌株的最佳閾值。

2 結 果

2.1臨床分離菌株檢測結果

2.1.1最佳檢測菌量的選擇 以Bactec MGIT960藥敏結果為標準，當加入孔內MTB菌株量終濃度為10.00-1mg/mL、10.00-2mg/mL時，50株已知藥敏結果的菌株顯示：無論是耐藥菌株還是敏感菌株，接種2 d后在各藥物濃度測試孔內可見微孔板底硅膠的顏色由天藍色逐漸變黃色，至7 d后陽性對照孔可觀察到微孔板底硅膠的顏色由天藍色逐漸變黃色，提示有MTB生長；接種10.00-3mg/mL濃度7～10 d時95%耐藥菌測試孔和對照孔可觀察到微孔板底硅膠的顏色由天藍色逐漸變黃色，敏感菌株測試孔孔底硅膠顏色無改變；當菌量10.00-4mg/mL時，10 d內對照孔無肉眼可見菌體生長出現，80%耐藥菌測試孔和30%對照孔14 d后可以觀察到微孔板底硅膠的顏色改變。基本確定本研究最佳檢測菌量終濃度為10.00-3mg/mL。

2.1.2臨床分離菌株的藥敏檢測結果 微孔板變色硅膠顯色法與Bactec MGIT960藥敏結果比較，50株MTB臨床分離株經過微孔板變色硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測藥敏結果(表1)。兩法檢測RIF藥敏結果相符49株，不符1株。以Bactec MGIT960藥敏結果為標準，微孔板變色硅膠顯色法檢測RIF靈敏度達94.12%，特異度為100%，準確度為97.43%，同Bactec MGIT960高度一致(符合率98.00%)，差異無統計學意義(χ2=0.92，P>0.05)。

2.1.3最佳藥敏結果報告時間比較 以Bactec MGIT960藥敏報告時間為參照，從菌液加入含RIF藥物培養板開始計時，Bactec MGIT960藥敏報告時間為4～13 d，平均7.70 d。微孔板變色硅膠顯色法檢測時間4～15 d，平均8.20 d。微孔板變色硅膠顯色法檢測時間稍長于Bactec MGIT960藥敏報告時間，但二者比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 兩種方法檢測RIF藥敏結果(n)

表2 二者檢測RIF藥敏報告時間比較[n=50,n(%)]

2.1.4最佳藥物敏感性判斷界值的選擇 根據50株Bactec MGIT960藥敏檢測結果，在最佳檢測菌量終濃度為10.00-3mg/mL條件下，微孔板變色硅膠顯色法檢測MTB臨床分離株的MIC分布為0.25 μg/mL 18株,0.50 μg/mL 8株,1.00 μg/mL 1株,2.00 μg/mL 7株,4.00 μg/mL 13株,8.00 μg/mL 3株,16.00 μg/mL 0株。經Medcalc分析ROC曲線下面積為(AUC)0.950、靈敏度95.61%、特異度99.12%。

2.2涂陽痰標本檢測結果

2.2.1二者檢測涂陽痰標本RIF藥敏結果 40例涂陽痰標本經過Bactec MGIT960培養及藥敏檢測敏感株21例，耐藥17例，培養陰性1例，鑒定為非MTB 1例；微孔板變色硅膠顯色法檢測結果為敏感株22例，耐藥16例，培養陰性1例，非MTB 1例。兩種藥敏方法結果相符合38株，不符合1株，符合率為97.44%(38/39)；靈敏度為94.12%(16/17)，特異度為100%(21/21)，準確度為97.37%(37/38)，兩種方法檢測結果比較差異無統計學意義(χ2=0.90，P>0.05)。

2.2.2微孔板變色硅膠直接檢測涂陽痰標本RIF藥敏時間 從處理后的標本加培養板或培養管開始計時，Bactec MGIT960藥敏報告時間為10～27 d，平均19 d。微孔板變色硅膠顯色法檢測時間8～42 d，平均20 d，痰涂陽標本檢測時隨標本中菌量的增多而減少，使用微孔板檢測儀觀察同一份標本在陽性對照孔、測試孔最佳報告時間和硅膠顏色改變的差異，可初步判斷痰標本中MTB異質性耐藥。而微孔板變色硅膠顯色法檢測時間稍長于Bactec MGIT960藥敏報告時間，但差異無統計學意義(P>0.05)。微孔板變色硅膠顯色法直接檢測涂陽痰標本RIF藥敏時間，見表3。

表3 微孔板變色硅膠顯色法直接檢測涂陽痰標本RIF藥敏時間(d)

3 討 論

基于耐藥結核病特別是耐RIF流行現狀，開發MTB快速藥敏檢測技術顯得迫切而重要。目前MTB表型快速藥敏檢測技術如Bactec MGIT960、微量液體MIC、藥物敏感度檢測技術(MODS)、液體變色培養等開始應用于一些較大型醫療機構，但因為存在設備、試劑昂貴或操作要求較高[8-10]，很難推廣應用。而一些成熟的基因檢測技術基于PCR-DNA為基礎，如高分辨率熔解曲線技術、XpertMTB/RIF技術、基因芯片技術等雖然快速、高效，但很難覆蓋所有的基因突變位點、不能區別活菌及死菌、不能判斷異質性耐藥、不能檢測MIC即不能鑒別低濃度耐藥還是高濃度耐藥[11-13]，實際使用受到限制。

本研究團隊綜合考慮了現有檢測技術的優缺點，設計制造出一新型快速MTB藥敏診斷產品，即含變色硅膠的微孔板。其基本設計原理為MTB生長過程中會產生CO2，CO2能和酸堿指示劑發生反應導致指示劑顏色改變來間接判讀MTB生長繁殖能力。既往一些檢測產品往往直接將指示劑加入培養基中[14]，可能導致結核桿菌生長環境改變并影響結果判斷，為徹底解決這一難題，本課題組利用硅膠具有固載酸堿指示劑離子和吸收CO2的性能[15]，將精選的酸堿指示劑離子(對二甲酚藍離子液體)通過特殊工藝固載到透明B型硅膠中，再將若干量成品塑形在24孔微孔板底部。實際檢測過程中，微孔板內如果有MTB生長，產生的CO2就被硅膠吸收并與其中酸堿指示劑發生反應導致硅膠顏色改變，肉眼就能觀察結果。且經過特殊處理B型硅膠具有低表面張力和低表面能優點[16]，有疏水、防粘等各項優異性能，防止了培養基中液體和固載在硅膠中的指示劑逆向流動；B型硅膠具有的惰性特點保證了MTB生長環境穩定。

本實驗組首先利用該產品對MTB臨床分離菌株進行RIF藥敏測試，這是因為MTB臨床分離菌株是具有繁殖能力強的優勢菌群、容易定量并能保證實驗結果判讀。通過對50株MTB臨床分離株藥敏測試并與Bactec MGIT960標準藥敏體系作對比[17-18]，本研究小組發現：該產品檢測最佳觀察時間為7～10 d；最佳接種菌量為10.00-3mg/mL，菌量太高因影響殺菌效果易造成假陽性，菌量太低，會延長觀察時間；確定RIF最佳MIC判斷界值為1.00 μg/mL，因為在該MIC判斷界值下，所檢測藥敏結果敏感性和特異性與Bactec MGIT960結果高度一致，證明微孔板變色硅膠顯色法性能可靠；通過ROC曲線分析，提示95%以上的特異度，說明利用該產品測得MIC值可以有效地判斷出MTB對RIF敏感株和耐藥株，能獲得較為詳細的菌株耐藥數據。

因為利用MTB臨床分離菌株進行檢測，必然需要先將臨床標本適當處理后進行培養，再將培養到的較純化的優勢菌進行下一步檢測，這就需要耗費較長時間，難以滿足臨床需要。本實驗組利用變色硅膠微孔板對涂陽痰標本直接進行RIF藥敏檢測，結果發現：(1)MIC判斷界值仍然為1.00 μg/mL，因為在該MIC判斷界值下，所檢測藥敏結果敏感性和特異性與Bactec MGIT960結果高度一致，均達到95.0%左右，能滿足對臨床痰標本直接檢測實驗要求。(2)最佳接種標本為近1個月未接受抗結核治療且分級計數3+、4+痰標本，經過換算4+痰標本經過適當處理檢測終濃度可達到或接近10.00-3mg/mL，即達到最佳檢測菌量[19]。而分級計數1+或已經過半月以上抗結核治療涂陽痰標本，MTB活力較弱或較少，觀察時間會明顯延長，對此類標本最好采用集菌方法。(3)痰標本中存在MTB異質性耐藥時，在最佳報告時間和硅膠顏色改變存在一定差異，肉眼判斷困難，使用微孔板檢測儀更能提高分辨率。通過對比結果如果提示MTB異質性耐藥，可考慮通過檢測結核RNA、DNA聯合結核培養等進一步明確診斷[20-21]。直接檢測涂陽痰標本RIF藥物敏感性進行了有益嘗試，進一步縮短了報告時間，提高了檢出效率，但尚需要大樣本測試才能確定相關檢測標準。本課題組為測試MTB藥物敏感性專門研發的這一產品，綜合考慮了硅膠負載技術、硅膠孔徑分布對CO2吸附性能、酸堿指示劑負載量及變色靈敏度、MTB在對數繁殖時產生CO2的能力等量效關系，并對疏水性能、溫度、酸堿度、惰性、CO2吸附性能進行了測試，達到直接檢測痰標本中MTB的藥敏要求，較其他的MTB表型藥敏檢測系統具有明顯的性價比優勢，能克服常用MTB分子藥敏技術的一些不確定性弱點。

微孔板變色硅膠顯色板這一新型MTB藥敏診斷產品目前還在多家協作單位不斷測試并進一步完善產品過程中，但該產品技術原理明確、具有成本低、準確、快速、操作簡單等優點，具有良好的推廣應用前景，向基層結核病防治機構推廣使用的前景值得期待。

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