1例遺傳性凝血因子V缺乏癥家系的基因分析

梁楓萍,程 鵬

(1.廣西壯族自治區玉林市第一人民醫院腫瘤血液科 537000; 2.廣西醫科大學第一附屬醫院血液內科,南寧 530021)

遺傳性凝血因子V(FV)缺乏癥是一種罕見出血性疾病，由FV結構或功能缺陷導致的常染色體隱性遺傳性疾病。本研究通過凝血功能及FV活性的檢測，確診了1例FV缺乏癥患者，并對其家系成員的FV基因進行測序，以尋找致病突變基因，探討其發病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，男，33歲，廣西賓陽人，漢族，自幼無異常出血表現，2014年因不育癥就診。查體：無陽性體征。實驗室檢查：凝血酶原時間(PT)38.7 s、活化部分凝血活酶時間(APTT)133.3 s ；凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)正常；FV促凝活性(FV∶C) 0.6%，其他凝血因子活性正常；血常規、肝功能正常。先證者父母，廣西賓陽人，非近親婚配；對先證者的直系家系成員包括先證者父親、母親、妹妹均進行凝血功能及基因檢測。家系成員中無皮膚、牙齦出血或外傷后出血不止等出血及出血傾向，家系成員血常規、肝功能均正常，未曾使用抗凝劑。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準并征得先證者及其家系成員知情同意。家系圖見圖1。

圖1 遺傳性凝血因子Ⅴ家系圖

1.2方法

1.2.1實驗儀器 PCR反應擴增儀(東勝龍)，3130xl測序列分析儀(美國ABI公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)，DYCP-31E型穩壓穩流電泳儀(北京六一)，YXJ-2離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)，凝膠成像系統(美國Gene Genius公司)，移液器(范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL)(德國Eppendorf公司)。

1.2.2主要試劑 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA Polymerase(美國Thermo公司F-549S)；Marker、6×DNA Loading Dye(上海生工生物技術有限公司)；PCR產物純化回收試劑盒(上海生工生物技術有限公司SK1141)；10×TAE(400 mmol/L Tris-acetate and 10 mmol/L EDTA，pH 8.0)。

1.2.3標本采集和處理 所有研究對象抽取外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，標本分2份，分別用于凝血功能分析及DNA提取。DNA提取后進行濃度和純度測定，將DNA分裝并凍存于-80 ℃備用。

1.2.4凝血功能分析 對先證者及家系成員進行PT、APTT、FⅡ∶C、FV∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C測定。

1.2.5引物設計 參照文獻[1]設計了30對引物(表1)，由上海生工生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物序列表

續表1 PCR引物序列表

1.2.6PCR擴增 PCR反應系為20 μL，包括10 μL PCR Mix ，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，超純水7 μL。在DNA熱循環儀上進行PCR擴增，反應條件如下：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，循環35次，最后72 ℃再延伸5～8 min。取PCR產物5 μL上樣于1.8%瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液中100 mV電壓電泳30 min后，將凝膠置于數字化凝膠成像分析儀內拍照分析。

表2 遺傳性凝血因子V缺乏癥家系成員凝血指標檢測結果

1.2.7PCR擴增產物純化及測序 PCR擴增產物回收純化，嚴格按純化試劑盒說明書操作，純化產物進行直接測序。以美國NCBI基因庫公布的序列AY364535為標準，采用Chroma軟件對測序結果進行分析比對，尋找基因變異位點。變異位點與NCBI中的SNP數據庫比對，確定是否存在人群基因多態性。最后對異常測序結果重新進行PCR擴增及正向、反向測序，進一步確定基因突變。

2 結 果

2.1凝血功能檢測結果 先證者及其妹妹APTT、PT明顯延長，先證者FⅤ∶C 0.6%，妹妹FⅤ∶C 0.3%，母親FⅤ∶C 27.4%；先證者及其家系成員FⅡ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C均在正常范圍內,見表2。

2.2測序結果 先證者FⅤ基因存在1個雜合錯義突變G16088C(Asp68His)；8個單核苷酸多態性(SNP)位點突變，雜合錯義突變A38529G(Arg485Lys)，純合錯義突變A58668G(Met1736Val)、A45888G(Lys830Arg)、A45909G(His837Arg)、A46088G(Lys897Glu)、純合同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C(Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)；先證者妹妹的基因型與先證者完全一致；先證者父親不存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，8個SNP位點均為雜合突變。先證者母親存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，8個SNP位點均為雜合突變。這些SNP位點與NCBI的SNP數據庫記錄的相一致，見表3、圖2～5。

表3 先證者及其家系成員FⅤ基因突變位點

核苷酸位點參照Genbank序列，AY364535；+：純合突變；±：雜合突變；-：無突變

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖2先證者第3外顯子正向測序結果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖3先證者妹妹第3外顯子正向測序結果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖4先證者母親第3外顯子正向測序結果

箭頭示相同位點與野生型一致

圖5先證者父親第3外顯子正向測序結果

3 討 論

FⅤ缺乏癥是由FⅤ結構或功能缺陷導致的常染色體隱性遺傳性疾病。患者常表現為皮膚黏膜出血、月經過多、創傷出血不止，但肌肉和關節出血少見，顱腦出血更是罕見[2]。凝血篩查實驗PT、APTT延長，即刻及孵育APTT糾正實驗可排除狼瘡抗凝物及FⅧ因子抗體，進一步行FⅤ∶C測定具有診斷意義。基因分析一般在臨床研究中進行，且由于傳統基因測序技術的局限性，5%～10%患者的基因突變無法檢測出來[3]，因此FⅤ∶C輕度下降的雜合突變患者，明確診斷仍面臨著挑戰。FⅤ缺乏癥分為兩型:Ⅰ型是FⅤ抗原(FⅤ∶Ag)和FⅤ∶C同步下降;Ⅱ型是FⅤ蛋白異常所致,呈FⅤ∶Ag正常而FⅤ∶C降低，或者FⅤ∶Ag和FⅤ∶C下降不平行。

成熟的FⅤ由2 196個氨基酸構成，分為5個功能區，即A1-A2-B-A3-C1-C2。活化的FⅤ(FⅤa)是異二聚體，重鏈區包括A1、A2及NH2端，輕鏈區包括A3、C1、C2及羧基端，通過二價金屬離子(2個Ca2+和一個Cu2+)非共價聯結[4-6]。編碼人類FⅤ的基因定位于1 號染色體q24.2，含25個外顯子及24個內含子。第1～12外顯子編碼信號肽和A1-A2區,第13外顯子編碼B區,14～25外顯子編碼A3、C1和C2區。

目前已發現了約160種與FⅤ缺乏癥有關的基因突變，包括無義突變、錯義突變、刪除、插入、剪切位點突變。錯義突變通常引起單個氨基酸置換，影響了FⅤ的折疊和構象改變，分泌途徑的質量控制系統將其滯留在細胞內，導致細胞內降解和分泌障礙[7]，這是大部分錯義突變導致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步降低的Ⅰ型FⅤ缺乏癥的機制。少數錯義突變(His147Arg、Tyr91Asn、Ala221Val和His147Arg)[8-9]，影響了二價金屬離子Cu2+的結合位點[9]、A1-A2-A3結構域的相互作用，導致了輕鏈和重鏈的相對分離，影響了FⅤa的穩定性，從而導致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C非同步下降的Ⅱ型FⅤ缺乏癥。雖然大部分的錯義突變位于A2和C2結構域，但越來越多發生在A1結構域的錯義突變被證實[10]。A1結構域是FⅤa和活化的FⅩ(FⅩa)相互反應的重要區域，此外，A1結構域存在重鏈與二價金屬離子Ca2+相互作用的位點，影響著FⅤa的輕鏈和重鏈的相互聯結[11]。因此，發生在A1結構域的突變不僅導致Ⅰ型FⅤ缺乏癥，也導致Ⅱ型FⅤ缺乏癥[12-13]。

曹麗娟等[1]通過分子建模分析發現，Asp68His突變發生后，維持A1區β片層結構的氫鍵及分子表面范德華力發生偏移，降低了分子結構的穩定性，從而影響FⅤ-Asp68His突變蛋白的折疊、細胞內轉運、分泌。

2014年臺灣國立成功大學的學者對FⅤ-Asp68His蛋白進行了體外表達研究證實，Asp68His突變導致了FⅤ分泌障礙，且FⅤ細胞內降解增強，從而引起FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步下降[14]。

本研究中，先證者自幼無異常出血表現，因不育癥就診檢查發現PT 38.7 s、APTT 133.3 s，FⅤ∶C僅0.6%，排除了肝病等獲得性因素導致的FⅤ∶C減低，且先證者母親和妹妹FⅤ∶C均降低，臨床診斷FⅤ缺乏癥明確。基因測序結果顯示先證者及其母親、妹妹均存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，家系分析表明先證者母親及妹妹均是Asp68His雜合錯義突變(圖2、3、4)，而父親相同位點與野生型一致(圖5)，提示該突變遺傳自母親，因此，基因水平診斷FⅤ缺乏癥明確。Asp68His突變是本研究中先證者及其妹妹、母親FⅤ∶C下降的主要原因。

先證者及其母親、妹妹基因突變類型均為雜合錯義突變，但三者的FⅤ∶C差異較大。對目前文獻報道的Asp68His突變FⅤ缺乏癥家系數據分析也發現FⅤ∶C水平的差異[1，15]，4個Asp68His雜合子的FⅤ∶C波動在45%～63%，1個Asp68His純合子突變的FⅤ∶C 5%，提示純合子突變患者的FⅤ∶C較雜合子突變下降明顯。本研究的先證者和其母親、妹妹都是Asp68His突變雜合子，但FⅤ∶C下降明顯，與文獻報道不一致，提示有其他的因素影響著FⅤ∶C。2010年黃丹丹等[16]報道的FⅤ缺乏癥患者證實是Asp68His雜合錯義突變，其FⅤ∶C 5%，其基因分析結果發現了位于同一條染色體上的4個SNP，分別導致了Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly突變，其研究結果認為，Asp68His雜合錯義突變和4個SNP共同導致了FⅤ∶C水平下降。YAMAZAKI等[17]的體外表達研究證實這4個多態性(Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly)同時存在時，FⅤ的表達水平比野生型顯著降低，約為野生型的20%，其原因是蛋白質合成率明顯降低并伴分泌障礙，其中Asp2222Gly是造成分泌障礙的關鍵因素。本研究的基因分析結果顯示，先證者及其妹妹存在4個純合錯義突變多態性(Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu)和1個雜合錯義突變多態性(Arg485Lys)，先證者母親存在這5個SNP的雜合形式，據此推斷，這5個SNP的存在影響了FⅤ∶C水平。此外，先證者及其母親、妹妹均存在同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C (Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)，突變并未引起編碼氨基酸改變，對FⅤ∶C無影響。

總之，Asp68His突變是導致先證者及其母親、妹妹FⅤ∶C下降的主要原因，Arg485Lys 、Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu 5種SNP的存在可能影響著FⅤ∶C。這5種SNP下調FⅤ∶C水平的具體機制有待進一步的研究。

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