回回藥方圣世散對先兆流產(chǎn)小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3表達(dá)的影響?

鄧玉娥，杜小利，李 娜，蘇 莉，張艷春

(寧夏醫(yī)科大學(xué)， 銀川 750004)

先兆流產(chǎn)是婦產(chǎn)科多發(fā)病之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病因多見免疫因素、遺傳因素、內(nèi)分泌因素、子宮解剖異常、感染因素等[1]。 目前，妊娠免疫耐受機(jī)理是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，在調(diào)節(jié)母胎界面免疫耐受中，Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡是調(diào)節(jié)母胎免疫的關(guān)鍵,當(dāng)正常妊娠母胎界面Th1/Th2平衡遭受破壞，Th1過度表達(dá)，將導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[2]。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子SOCS1、SOCS3在胚胎期參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡，以維持正常妊娠[3]。

先兆流產(chǎn)屬于中醫(yī)學(xué)“胎漏”“胎動(dòng)不安”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為先兆流產(chǎn)多因腎虛胎元失固引起?；鼗厮幏绞ナ郎⒃从凇痘刈遽t(yī)方集萃》[4]，原方由桑寄生、菟絲子、阿膠、白術(shù)、蕨麻、苧麻根、杜仲、續(xù)斷8味中藥組成，具有補(bǔ)腎安元、益氣固脫之功。臨床研究表明，圣世散可調(diào)節(jié)先兆流產(chǎn)患者血中HCG、E2及P水平，改善其黃體功能，保胎有效率達(dá)88.6%[5]。目前對圣世散發(fā)生藥效的分子機(jī)制研究尚無報(bào)道，故動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過檢測先兆流產(chǎn)小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)含量，從分子水平初步探討圣世散保胎的免疫機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級6～8周齡18～22 g雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/C小鼠6只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

圣世散飲片購自寧夏明德中藥飲片有限公司，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院中藥房中藥師鑒定合格。將8味藥水煎回流濃縮至含生藥量1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.3.1 儀器 冰凍切片機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物組織包埋機(jī)、OLYMPUS BX51- DP71研究級正置熒光顯微鏡。

1.3.2 試劑 SV0002-兔IgG兩步法免疫組化試劑盒、兔多克隆抗體SOCS1、SOCS2、SOCS3、DAB顯色試劑盒等。

2 方法

2.1 分組與造模

將雌性CBA/J小鼠48只與雄性DBA/2小鼠24只按2∶1的比例合籠隨機(jī)分為先兆流產(chǎn)模型組和圣世散高、中、低劑量組，次日早晨取雌鼠檢查陰道栓，以孕鼠陰道口用無菌小棉簽探測到有血且體質(zhì)量明顯下降，而無妊娠物排出確定為先兆流產(chǎn)癥狀；將雌性CBA/J小鼠12只與雄性BALB/C小鼠6只按2∶1比例合籠建立正常妊娠組，同法觀察記錄受孕情況。

2.2 分組與給藥

各組從妊娠第0天開始灌胃給藥，圣世散低、中、高劑量組給藥劑量分別為含生藥量3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，正常妊娠組及先兆流產(chǎn)模型組給予相同體積蒸餾水，連續(xù)灌胃14 d。

2.3 標(biāo)本采集與處理

2.3.1 計(jì)算各組孕鼠胎盤平均質(zhì)量 孕鼠連續(xù)灌胃給藥14 d，末次給藥1 h后取胎盤組織計(jì)數(shù)并稱總質(zhì)量。胎盤平均質(zhì)量=胎盤總質(zhì)量÷胎盤個(gè)數(shù)，比較各組胎盤平均質(zhì)量差異。

2.3.2 免疫組化染色 取孕鼠蛻膜和胎盤組織石蠟包埋，冰凍切片機(jī)切片(5.0 μm)、貼片，3%雙氧水封閉10 min，5%BSA血清封閉30 min，加一抗(SOCS1、SOCS3、1∶250)過夜，加二抗(聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、封片，光鏡下觀察、照相。

2.3.3 HE染色 取胎盤組織石蠟切片標(biāo)本，5%伊紅酒精染色,封片，光鏡下觀察，照相。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般情況

正常妊娠組小鼠精神狀態(tài)佳，皮毛有光澤，未見陰道口流血現(xiàn)象。其他各組均出現(xiàn)不同程度精神狀態(tài)欠佳、毛色干枯、活動(dòng)力下降等癥狀，部分可見陰道口有血漬，先兆流產(chǎn)模型對照組表現(xiàn)尤為明顯，各組均未見妊娠物排出。

4.2 5組孕鼠胎盤平均質(zhì)量比較

表1顯示，與正常妊娠組比較，先兆流產(chǎn)模型組的胚胎質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；與先兆流產(chǎn)模型組比較，圣世散高、中劑量組孕鼠胎盤質(zhì)量均增加(P<0.05)，圣世散低劑量組無明顯變化(P>0.05)。

表1 各組孕鼠胎盤平均質(zhì)量比較

注：Fa=5.254，Pa=0.002；與正常妊娠組比較：*P<0.05；與先兆流產(chǎn)模型組比較：#P<0.05

4.3 光鏡觀察結(jié)果(HE染色)

圖1顯示， 每組均放大400倍拍攝胎盤蛻膜組織。

圖1 各組小鼠母胎界面HE染色結(jié)果(10×40)

4.4 免疫組化染色結(jié)果

4.4.1 免疫組化法 表2圖2、3顯示，檢測圣世散對小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)的影響。圖2、3顯示，5組小鼠母胎界面均可見SOCS1和SOCS3蛋白棕黃色陽性表達(dá)區(qū)域，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核藍(lán)染，各組陽性表達(dá)強(qiáng)弱不等。

5 討論

正常機(jī)體發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞主要是T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞在接受抗原刺激后可分化為Th1和Th2型2個(gè)細(xì)胞亞群。Th1主要分泌IL-2(白介素-2)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)并參與炎癥反應(yīng)和組織損傷；Th2主要分泌IL-4、IL-6，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)抗體形成并抑制免疫炎癥發(fā)生，減少細(xì)胞過度損傷，抑制Th1型細(xì)胞的產(chǎn)生[6]。

表2 各組小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)平均光密度值水平比較

注：Fa=41.551，Pa=0.000；Fb=18.327，Pb=0.000；與正常妊娠組比較：*P<0.05；與先兆流產(chǎn)模型組比較：#P<0.05

圖2 各組小鼠母胎界面SOCS1免疫組化染色結(jié)果(10×40)

圖3 各組小鼠母胎界面SOCS3免疫組化染色結(jié)果(10×40)

正常妊娠期胚胎蛻膜中，由Th1分泌的TNF-α可調(diào)節(jié)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的生長分化，促進(jìn)孕酮的分泌，有利于胎兒的生長發(fā)育。但過多的TNF-α可促進(jìn)蛻膜和絨毛膜中前列腺素E2的合成及釋放，導(dǎo)致子宮平滑肌收縮而發(fā)生流產(chǎn)[7]；由Th1分泌的IL-2在適量濃度時(shí)可發(fā)揮特異性免疫屏障的作用，但若IL-2異常上調(diào)則會(huì)損害胎盤組織[8]；由Th2分泌的IL-4可下調(diào)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，IL-6可調(diào)節(jié)胎盤激素的合成及胚胎的著床，抑制母體排斥反應(yīng)以維持妊娠[9]。由此得知，Th1/Th2細(xì)胞因子與自然流產(chǎn)有密切關(guān)系。

研究認(rèn)為，人與小鼠免疫網(wǎng)絡(luò)Th1/Th2細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)主要是被 SOCS1、SOCS3 蛋白所控制[10]。Thl、Th2均可誘導(dǎo)SOCS1、SOCS3產(chǎn)生，而這2種蛋白反過來可抑制上述細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)過程[11]。SOCS1主要表達(dá)在Th1細(xì)胞中，并通過抑制Th2細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)通路而抑制其免疫反應(yīng)；SOCS3蛋白則主要表達(dá)在Th2細(xì)胞中并通過抑制Th1細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)通路而抑制其免疫反應(yīng)，使T細(xì)胞的分化朝著有利于妊娠維持的Th2細(xì)胞分化[12]。由此看來，SOCS1、SOCS3對Thl/Th2平衡調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)腎健脾中藥有調(diào)節(jié)免疫-內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的功能，對先兆流產(chǎn)能起到綜合治療的作用[13]?；鼗厮幏绞ナ郎⒕哂醒a(bǔ)腎安元、益氣固脫之功，為驗(yàn)證圣世散的臨床療效，杜小利[14]等選取70例患者，其中治療組35例患者給予圣世散煎劑口服，臨床保胎有效率88.6%。對照組35例口服維生素E、肌肉注射黃體酮，保胎有效率74.3%，結(jié)果表明圣世散治療先兆流產(chǎn)優(yōu)于西藥對照組。

實(shí)驗(yàn)選取的CBA/J×DBA/2先兆流產(chǎn)動(dòng)物模型，其受孕雌鼠CBA/J具有圍著床期反復(fù)自然流產(chǎn)的特點(diǎn)，與人類反復(fù)自然流產(chǎn)發(fā)生時(shí)期相似[15]。趙愛民[16]等發(fā)現(xiàn)，CBA/J×DBA/2小鼠模型CBA/J孕鼠外周血Thl型細(xì)胞因子濃度顯著高于正常妊娠組，而Th2則顯著低于正常妊娠組，這表明CBA/J×DBA/2先兆流產(chǎn)小鼠模型是以Th1/Th2平衡失調(diào)為流產(chǎn)機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)從Th1/Th2平衡調(diào)控蛋白SOCS著手，更深層次地探討圣世散的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，正常妊娠組小鼠母胎界面SOCS1低表達(dá)，SOCS3

高表達(dá)；先兆流產(chǎn)模型組SOCS1表達(dá)明顯升高，SOCS3明顯下降；圣世散高、中劑量組SOCS1、SOCS3表達(dá)接近正常妊娠組，從而證實(shí)圣世散保胎機(jī)理可能是通過升高母胎界面SOCS3表達(dá)水平，降低SOCS1，促使T細(xì)胞的分化偏向于Th2型細(xì)胞因子，間接抑制Th1型細(xì)胞因子及其胎盤損害作用，維持Thl/Th2平衡而保護(hù)胚胎。

參考文獻(xiàn)：

[1] 樂杰．婦產(chǎn)科學(xué)[M]．7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：83-85.

[2] 尤昭玲，賴毛華．何冬梅,等.正常妊娠與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母界面SOCS1、SOCS2和SOCS3mRNA 表達(dá)的差異[J]．中國中醫(yī)藥科技，2008，15(6)：4531-4535.

[3] LINDEMANN C,HACKMANN O,DELIC S,et al. SOCS3 promoter methylation is mutually exclusive to EGFR amplification in gliomas and promotes glioma cell invasion through STAT3 and FAK activation[J]. Acta Neuropathol,2011，122(2):241-251.

[4] 高如宏，陳衛(wèi)川.回族醫(yī)方集粹[M]．寧夏：人民出版社，2008：213-214.

[5] 杜小利，吳心芳，羅文玉,等．回回藥方圣世散對早期先兆流產(chǎn)患者血人絨毛膜促性腺激素、雌激素及孕激素的影響[J]．四川中醫(yī)，2013，31(11)：63-64.

[6] 蘇艷姣，劉宏奇.中醫(yī)藥治療Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡致自然流產(chǎn)的機(jī)理研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2016，2(14)：146-148.

[7] 王若光，尤昭玲，劉小麗,等．黃芪丹參復(fù)方成分對妊高征模型孕鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶及血管內(nèi)皮生長因子mRNA 表達(dá)影響研究[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12(2)：44-47.

[8] 周雯慧，杜美蓉，李大金,等．環(huán)素A對人蛻膜免疫細(xì)胞分泌IL-10與IFN-γ 的調(diào)控作用[J]．現(xiàn)代免疫學(xué)，2006，26(4)：314-317.

[9] 孫燕，陳佩．TNF-á和IL-6 與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究[J]．中國婦幼保健，2012，25(27)：3940-3943.

[10] KUBO M，HANADA T，YOSHIMURA A．Suppressors of cytokine signaling and immunity[J]．Nature Immun，2003，41(3)：1169-1176.

[11] KREBS D L，HILTON D J．SOCS physiological suppressors of cytokine signaling[J]．Sci，2000，113(16)：2813-2819.

[12] SEKI Y H, INOUE N, NAGATA N, et al. SOCS-3 regulates onset and maintenance of Th2 mediated allergic responses [J]. Nat Med, 2003,9(8):1047-1054.

[13] 徐曉琴，徐向榮． 補(bǔ)腎中藥對卵巢早衰患者卵巢儲(chǔ)備功能及免疫調(diào)節(jié)影響的研究[J]．中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12(12)：2004-2006.

[14] 杜小利，朱寧娃．回回藥方圣世散治療先兆流產(chǎn)35例[J]．中醫(yī)雜志，2012，53(3)：247.

[15] 林羿，曾耀英．反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠妊振免疫耐受機(jī)理研究[J]．中華婦產(chǎn)科雜志，2002，37(2)：122-123.

[16] 趙愛民，林其德．Th1和Th2型細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性[J]．上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20(S1)：16-18.