TGF-β1及其受體TGFBR2基因多態性與單純收縮性高血壓的關系研究

張小英 俞莎莎 陳文采 陳曉峰 任劍飛

單純收縮性高血壓（isolated systolic hypertension,ISH）是一種由環境與遺傳因素相互作用所致的疾病，也是導致腦卒中、充血性心力衰竭、冠心病、腎功能衰竭的發病率和病死率升高的主要危險因素之一，但其病因和發病機制尚未完全闡明。近年來，隨著對轉化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的深入研究，發現其對血管平滑肌細胞增殖、成纖維細胞增生以及介導心血管疾病的發生起著重要作用[1-2,4]。TGF-β1 通過與受體 2（transforming growth factor-β1 receptor 2,GFBR2）的結合,磷酸化Smads啟動細胞內信號傳導，在血管結構和功能病變的發生、發展中發揮著重要的作用。很多研究表明，TGF-β1、TGFBR2存在基因多態性，與原發性高血壓的易感性及發展過程密切相關[1-3]，而與ISH的關系尚不清楚。本研究從遺傳學的角度出發，運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCRRFLP）技術，通過病例-對照研究，分析TGF-β1基因的-869T/C位點，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點的基因多態性與ISH的相關性，為ISH的預防、診斷和治療提供一定的理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 2014年2月至2015年2月在寧波市醫療中心李惠利醫院心內科住院的高血壓患者及健康體檢者中,符合1999年WHO/ISH的診斷標準（收縮壓≥140mmHg,舒張壓＜90 mmHg）的ISH患者103例。以患者在3個不同時間安靜狀態下測量血壓的平均值為準。同時排除繼發性高血壓、心肌病、先天性心臟病、風濕性心瓣膜病、糖尿病、腎病等。患者均無長期飲酒嗜好，無肝、膽、胰、脾、肺、腎及內分泌、自身免疫性疾病。另以病史、體格檢查、心臟B超等檢查無異常的169例健康者為對照組，兩組臨床資料中僅收縮壓的差異有統計學意義，其他指標的差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。以上研究對象均為漢族人群（無血緣關系），均對本研究知情同意。

表1 兩組對象臨床資料的比較

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 清晨空腹采集靜脈血,EDTA抗凝,按照寶生物工程（大連）有限公司血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。取A260/280比值為1.7～2.0的DNA標本用于后續PCR-RFLP基因分型研究。

1.2.2 PCR-RFLP聯合測序法檢測單核苷酸多態性 根據Genebank基因庫序列信息，在TGF-β1基因的-869T/C位點，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點及其側翼區設計特異性擴增引物。引物參照文獻及使用相關軟件設計，引物由上海捷瑞生物公司合成。PCR擴增獲得特異性產物。

1.2.3 基因型鑒定 取適量PCR產物行限制性內切酶消化，37℃溫育16h，終止酶切反應，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像系統判定結果。對其中部分基因型的PCR擴增產物，進行膠回收、過柱純化,送上海生工生物公司作DNA測序驗證。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料采用 表示，兩組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗，并采用logistic回歸進行多因素分析，計算OR（95%CI）值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1基因的-869T/C位點、TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點的測序圖運用PCR-RFLP聯合測序法檢測TGFβ1基因的-869T/C位點，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點的基因多態性，見圖1。

圖1 TGF-β1基因的-869T/C位點、TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點的測序圖

2.2 TGF-β1基因型和等位基因頻率分布

表2 兩組TGF-β1基因的-869T/C位點的多態性分布［例（%）］

由表2可見，ISH組TGF-β1基因-869T/C各位點與對照組比較均無統計學差異（均P＞0.05)。

2.3 TGFBR2的基因型和等位基因頻率分布見表3～4。

表3 兩組TGFBR2基因的-3779A/G位點的多態性分布［例（%）］

表4 兩組TGFBR2基因的-1444C/G位點的多態性分布［例（%）］

由表3、4可見，ISH組TGFBR2基因的-3779A/G、1444C/G各位點與對照組比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

3 討論

ISH的病因和發病機制至今尚未闡明，TGF-β是調節細胞生長、分化、基質生成和組織修復的多潛能生長因子,能促進膠原、纖維連接素、層黏素等多種蛋白多糖合成。研究表明TGF-β1可能與高血壓有關，尤其是位于信號肽序列區第1外顯子的869T/C的基因多態性，大多研究表明C等位基因可能是高血壓的危險因素[4-6]。TGF-β1通過與TGFBR2的結合發揮作用，許多研究提示TGFBR2基因與心血管疾病相關，如心臟驟停、Marfan syndrome、先天性心臟病等[7-9]。在Huang等[9]的最新研究中，發現TGFBR2基因上的-3779A/G位點和-1444C/G位點與中國人群的先天性心臟病有關聯。而心血管疾病與高血壓密切相關。因此在我們此次對ISH的研究中，主要對TGF-β1基因的869T/C位點，以及TGFBR2基因上的-3779A/G位點和-1444C/G位點進行測序研究其單核苷酸多態性，進一步闡明TGF-β1與ISH之間的關系。

在本研究中，我們發現TGF-β1基因的869T/C單核苷酸多態性與ISH之間無明顯統計學差異，其實在不同人群中，TGF-β1基因的869T/C基因多態性與高血壓的關聯研究結果存在爭議。早在2002年日本學者Yamada等[10]的研究表明TGF-β1基因的869T/C多態性與高血壓無統計學差異，但C等位基因與日本女性高血壓顯著相關，而與日本男性高血壓不相關，這提示基因多態性不僅存在種族、民族及地域的差異[11]，也可能受性別影響。在研究TGF-β1基因的869T/C單核苷酸多態性與新疆漢族原發性高血壓的關系中，發現兩者缺乏關聯[12]。本研究也提示TGF-β1基因的869T/C位點多態性可能不是ISH發病的重要影響因素，可能與本研究樣本量小，且性別沒有排除有關。

本研究中，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G這2個位點的基因多態性與ISH也無統計學差異。在陳金鳳等[13]的研究中提示TGFBR2基因的-1444C/G位點與原發性高血壓有關聯，按年齡、性別、吸煙、飲酒等因素進行分層分析結果顯示，在≥55歲人群中，攜帶突變G等位基因型（CG+GG）者高血壓患病風險增加，而-3779A/G位點基因型、等位基因型與高血壓的關聯均無統計學意義。本研究結果與其不一致，在本研究中，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G這2個位點的基因多態性與ISH無關聯。我國漢族人群ISH組與對照組的TGF-β1基因的869T/C基因型與等位基因頻率統計學差異，且TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點的多態性與ISH也并無明顯相關聯。可能與下面的因素相關：首先，研究樣本偏少，研究數量有限；其次，由于時間、經費的限制，沒有測定血漿TGF-β1、TGFBR2含量，無法得知基因多態性對其含量的影響；再次，沒有對樣本按性別、年齡、吸煙等因素分層進行深入分析，且血壓遺傳度、單核苷酸多態性在不同人群中分布頻率有差異，可能導致基因雜合程度的差異。

我們期待將來能有更大樣本、更全面的關于ISH分子遺傳學研究，為診斷、治療及預防提供更好的思路。

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