MDS、AML患者T淋巴細胞及相關細胞因子表達水平的研究

郭含夢，倪 婧，鄭美娟，陳 冰，楊明珍,

骨髓增生異常綜合征(myeodysplastic syndromes，MDS)起源于造血干細胞，骨髓中存在分化、成熟障礙的異常細胞，導致病態造血發生，在骨髓原位或釋放入血后不久被破壞，導致無效造血，是一種高風險向急性髓系白血病轉化的難治性血細胞質、量異常性疾病。白血病是一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病，因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，因而停止在細胞發育的不同階段。發病時骨髓中異常的原始細胞及幼稚細胞大量增殖并抑制正常造血[1]。大量的臨床和實驗數據[2-3]表明，免疫機制參與MDS的發病機制，低風險MDS的特點是自身免疫介導的骨髓抑制,骨髓的細胞凋亡增加具有自身免疫性特點，多種免疫分子參與導致過度細胞死亡，而高風險MDS包括免疫逃避和次級DNA損傷,原始細胞大量增殖從而可進展為急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)。因此，免疫機制對MDS疾病發生發展產生怎樣影響以及不同時期MDS和AML的免疫情況有何差異值得探究。該研究通過流式細胞儀檢測MDS、AML患者調節性T細胞(regulatory cell，Treg)水平，通過流式細胞微球芯片捕獲術(cytometric bead array，CBA)檢測Th1細胞分泌的細胞因子白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、Th2分泌的白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)以及Th17分泌的白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)表達水平作對比分析，從而探討MDS、AML的免疫功能狀態與疾病發生發展的關系，并為疾病是否需要進行免疫抑制劑治療提供依據。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年10月～2017年8月在安徽醫科大學第一附屬醫院血液科收治的MDS、AML共35例，所有患者符合診斷標準[1]。AML患者15例，男7例，女8例，年齡25～75歲，中位年齡38歲，其中M3患者2例、M2患者6例、M4患者2例、M5患者4例、M6患者1例，MDS患者20例，男15例，女5例，年齡29～75歲，中位年齡53歲，根據FAB分型分為兩組[1]，骨髓原始細胞<5%的難治性貧血(refracrory aremia,RA)及難治性貧血伴有環形鐵粒幼細胞(RA with ring sideroblst，RARS)為RA組，骨髓原始細胞>5%的難治性貧血伴原始細胞增多(RA with an excess of blast, RAEB)、轉化中的RAEB(RAEB in transformation,RAEB-T)、慢性粒單核細胞白血病(chronic myelo-monocytic leukemia,CMML)為RAEB組，其中RA組(低風險MDS)10例，RAEB組(高風險MDS)10例。正常對照組10例，為安徽醫科大學第一附屬醫院同期健康體檢者，其中男5例，女5例，年齡25～75歲，中位年齡46歲。

1.2試劑與儀器CBA人Th1/Th2/Th17細胞因子檢測試劑盒、淋巴細胞分離液購自美國BD公司，Treg (CD4+CD25+Foxp3+)檢測試劑包括FITC-CD4、PE-CD25、Alexa647-Foxp3購自美國BD公司。流式細胞儀、12×75 mm FalconTM流式上樣管、15 ml聚丙烯圓錐底離心管購自美國BD公司，5810R離心機購自德國Eppendorf公司，生物安全柜購自美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1Treg的測定 ① 取外周血100 μl，分別加入CD4-FITC /CD25-PE 混合液5 μl；② 混勻，4 ℃避光孵育15 min，加1 ml溶血素混勻，避光孵育10 min; ③ 1500 r/min離心5 min，棄上清液，加1 ml PBS，離心，棄上清液；④ 加100 μl固定液，避光孵育40 min；⑤ 加穿膜液1 ml，1 500 r/min離心5 min；⑥ 加5 μl FOXP3抗體、避光孵育1 h；⑦ 加1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min，棄上清液；⑧ 加200 μl PBS，上機操作；⑨ 應用流式細胞儀測定表達CD4+CD25+Foxp3+的細胞比例。

1.3.2細胞因子的測定 ① 配置標準管：根據說明書使用分析稀釋劑以及人Th1/Th2/Th17細胞因子標準管配置標記TOP，1 ∶2，1 ∶4至1 ∶256各空標準管；② 配置測試管：配備人IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ捕獲珠混合液，按照每個樣本(標準品)加50 μl捕獲珠混合液計算比例混勻；③ 配備好的捕獲珠混合液200 r/min離心5 min，棄上清液加入同等體積的血清增強緩沖液，混勻，避光30 min；④ 取50 μl捕獲珠混合液分別加入測試管(每管加入50 μl患者血清)，然后每管分別加入50 μl捕獲抗體；⑤ 向標記為TOP，1 ∶2，1 ∶4至1 ∶256的各標準管中，每管分別加入已配備好的相應50 μl標準管試劑，每管均再加入50 μl捕獲珠混合液和50 μl捕獲抗體，混勻，避光3 h；⑥ 孵育完畢后分別加入1 ml洗滌緩沖液，200 r/min離心5 min，棄上清液；每管加入300 μl洗滌緩沖液，上流式細胞儀檢測；⑦ 用CBA軟件分析：用TOP至1 ∶256各標準管的流式結果繪制IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF及IFN-γ各細胞因子標準曲線，在標準曲線下得出各測試管IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF及IFN-γ的含量，見圖1。

2 結果

2.1各組與總體比較結果各指標組間總體比較差異均有統計學意義，Treg、TNF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17的F值依次為27.650、16.277、102.800、37.537、7.333、92.453、69.594、457.892。

2.2各實驗組與正常對照組比較結果MDS組IFN-γ、TNF、IL-17、IL-6、IL-2表達水平較正常對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)， IL-4、IL-10、Treg表達水平差異無統計學意義；RA組Treg、IL-6、IL-4表達水平差異無統計學意義，TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較正常對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-10表達水平較正常對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)；RAEB組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較正常對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF表達水平較正常對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平差異無統計學意義；AML組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較正常對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF表達水平較正常對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平差異無統計學意義。

2.3各實驗組間相互比較結果與MDS組比較，AML組Treg、IL-10、IL-6表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-4差異無統計學意義；與RA組比較，RAEB組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)；AML組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與RAEB組比較，AML組Treg表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)，其余7種細胞因子差異無統計學意義。細胞因子表達水平見表1。

表1 各組Treg、IL-10、IL-6、IL-4、TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平

圖1 外周血中細胞因子的表達水平

3 討論

眾所周知，免疫系統是人體主要的防御機構，對辨識、消滅、排除“非自體物質”起到重要作用，其功能的亢進與抑制都會導致疾病的發生，其中T淋巴細胞在其中占有很重的比例。Treg是一群調節機體免疫反應的淋巴細胞，有維持自身免疫耐受及避免免疫反應過度損傷機體的作用，同時參與腫瘤細胞的免疫逃逸。Th細胞可根據所分泌的不同功能的細胞因子分為Th1、Th2細胞，Th1細胞主要參與細胞免疫，Th2細胞主要參與體液免疫，兩者間的平衡是免疫調節重要環節，平衡失調可引起免疫缺陷。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細胞因子，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子。Th17是新發現的T細胞亞群，其主要效應因子為IL-17，在誘導炎癥、自身免疫組織損傷方面有重要作用，部分研究[2-9]表明其在保護性抗腫瘤免疫方面也存在影響。

本研究結果顯示，與正常對照組相比，MDS組IFN-γ、TNF、IL-17、IL-6、IL-2表達水平較高，其他細胞因子水平差異無統計學意義。對MDS進一步進行分層分析結果表明，RA組TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較高， RAEB組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較高，同時兩組之間相互比較，與RA組相比，RAEB組Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較高，TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表達水平較低，以上各組間比較差異均有統計學意義。從上述結果可看出，在低風險MDS階段，Th1/Th2的平衡中Th1占優勢地位，Th17/Treg平衡中Th17占優勢地位，而在高風險MDS階段，Th2及Treg占優勢地位。這與大多數研究結果相符合，由此可以看出在MDS發展的不同階段，其T淋巴細胞的免疫狀態也不同。而RAEB組與AML組比較，AML組Treg表達水平較高，差異有統計學意義，其余7種細胞因子差異無統計學意義，可以看出兩組有相似的免疫狀態，這與多數研究[5-10]結果相一致。

MDS是一種造血干細胞異常克隆的疾病，通過無效以及病態造血導致外周正常血細胞減少。多項研究[10-11]表明，Th1以及Th17分泌的細胞因子主要具有負性調節作用，因此在低風險MDS，Th1及Th17占據優勢，主要發揮免疫介導的過度細胞凋亡以及清除異常細胞、抗腫瘤的作用，并且少量的Treg可激活自動反應T細胞克隆，促進細胞凋亡程度，使造血干細胞以及祖細胞破壞增加，從而引起骨髓衰竭。因此在臨床實驗中可見，部分MDS患者通過免疫抑制劑治療可延緩病情進展。

對于MDS-RAEB及AML，兩者診斷標準主要區別在于原始細胞比例的不同，在MDS-RAEB中原始細胞進一步累積發展可轉化為AML。根據研究結果，與正常對照組比較，兩組均提示Treg、IL-10、IL-6、IL-4表達水平較高。在高風險MDS以及AML中，Th2及Treg占據優勢，Th2分泌的細胞因子以及Treg主要具有免疫抑制、增加免疫耐受的作用，并可介導腫瘤細胞參與免疫逃逸，促進異常細胞的擴張以及疾病發展，Th1以及Th17的減少也導致機體對于清除異常細胞能力的下降[12-15]。因此，在RAEB及AML中，原始細胞的增加、免疫功能的抑制兩者相互影響，導致機體內腫瘤細胞不斷累積影響正常造血功能。此時免疫抑制劑治療效果不佳，僅能通過化療、造血干細胞移植等大量殺滅腫瘤細胞的治療手段獲得療效。而對于AML、MDS-RAEB組Treg表達水平較高，可能提示AML腫瘤細胞進一步累積，免疫系統進一步破壞，從而提示疾病的進展。

綜上所述，不同階段MDS、AML具有不同免疫狀態，低風險MDS系負性調節因子過多導致細胞凋亡引起骨髓造血功能衰竭，而高風險MDS及AML則是免疫抑制以及免疫逃逸增加，腫瘤細胞不斷積聚導致正常造血功能障礙。

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