基于基因芯片探索鼻咽癌的分子靶標

劉玉智，門劍龍，李楊△

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種鱗狀細胞癌，常見于鼻咽側壁咽鼓管口周圍［1］。作為頭頸部最常見的癌癥類型，NPC是中國南方和東南亞地區發病率較高的惡性腫瘤之一［2］。放射治療和化學治療分別是早期和晚期NPC的主要治療方法。盡管早期、局部的NPC患者大多數情況下是可治愈的，但大多數患者在就診時已經被診斷為晚期，淋巴結轉移、遠端器官轉移和局部病灶復發是晚期NPC患者預后不良的主要原因［3］。根據第七版美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期手冊，晚期NPC患者的5年生存率較低（Ⅲ期為62%，Ⅳ期為38%）［4］。研究發現病毒感染、遺傳因素和環境因素均與NPC的發病相關，但其潛在的分子機制仍不明確［5］。利用分子生物學手段研究疾病的發病機制與病理過程是當前癌癥領域研究的發展趨勢；而通過表達譜芯片或轉錄組測序技術，在mRNA水平分析基因的表達，是篩選疾病相關基因最有效的途徑。本研究利用生物信息學手段綜合分析兩套NPC表達譜芯片數據，并利用實時熒光定量PCR和Western blot在mRNA水平和蛋白水平進行驗證，以期找到在NPC發生發展過程中起關鍵作用的基因。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司；PCR引物由華大基因公司合成；熒光定量PCR酶購自諾唯贊公司；Western blot裂解液購自天根公司；anti-CDC6、anti-CDK1購自abcam公司；anti-CCNB1購自LifeSpan BioSciences公司；anti-MCM2購自CST公司、山羊抗兔二抗購自CST公司。

1.2 數據預處理 以nasopharyngeal carcinoma為關鍵詞，在GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中篩選出2套符合條件的基因芯片數據（GSE12452和GSE13597）。數據GSE12452中包含10個鼻炎黏膜組織樣本和31個NPC樣本，數據GSE13597中包含3個對照鼻炎黏膜組織樣本和25個NPC樣本。原始數據采用R編程語言的affy包對芯片探針水平上的表達值進行背景校準和Robust Multi-array Average（RMA）標準化；并且，利用芯片平臺的注釋包把探針符號轉化為基因符號，對于多個探針對應同一個基因符號的情況，以這些探針表達值的平均值作為該基因的表達值。

1.3 基因差異表達分析 NPC組織與鼻炎黏膜組織基因表達差異采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。基因的相對表達差異以“NPC/Control”表示，以P＜0.05并且|log2（NPC/Control）|＞1為閾值，篩選差異表達基因。

1.4 基因功能分析和信號通路分析 采用美國國立衛生院（National Institutes of Health，NIH）的 DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）軟件平臺對差異表達基因進行聚類分析。以P＜0.05和至少富集10個基因為條件，篩選相關的GO（gene ontology）條目和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路。

1.5 組織標本 鼻咽癌石蠟標本5例（NPC 1～NPC 5）來源于天津醫科大學總醫院病理科，對照鼻炎黏膜組織新鮮標本5例（Control 1～Control 5）來源于天津醫科大學總醫院耳鼻喉科門診。全部組織標本資料信息見表1。

1.6 總RNA提取與實時定量PCR（real-time PCR） 取50～100 mg組織樣品，利用TRIzol法提取總RNA，取2 μg總RNA經M-MLV逆轉錄酶逆轉成cDNA后進行PCR反應，PCR引物序列見表2。PCR反應程序為預變性：94℃5 min；循環反應：（95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s）×40；溶解曲線：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95℃15 s。基因相對表達水平采取2-ΔΔCt相對定量法計算。

1.7 Western blot 分別選取NPC 1～4組織和Control 1～4組織，裂解液裂解組織，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入一抗anti-CDC6、anti-CDK1、anti-MCM2、anti-CCNB1，在37℃箱孵育1 h；TBST漂洗5 min×4次；加山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃作用1 h；TBST 漂洗5 min×4次；暗室避光X線膠片曝光，用化學發光法顯影。

1.8 統計學方法 采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Information of tissue specimen表1 組織標本資料信息

2 結果

2.1 差異表達基因 本研究在數據GSE12452中找到1 701個差異表達基因，其中988個基因表達下調，713個基因表達上調；數據GSE13597中找到869個差異表達基因，其中363個基因表達下調，506個基因表達上調。為了進一步篩選在NPC發生發展過程中起關鍵作用的基因，對兩套基因芯片數據的結果取交集，獲得了260個差異表達基因。

2.2 基因功能分析和信號通路分析 篩選出16個GO條目和4個KEGG信號通路，見表3、4。

2.3 Real-time PCR驗證基因芯片結果 利用realtime PCR技術檢測18個細胞周期相關基因在NPC組織中和鼻炎黏膜組織中的mRNA表達水平，結果發 現 CDC6、CDK1、SKP2、TTK、CHEK1、MCM2、CDK4、MCM4、CCNB1、CDC45、MYC、CCNA2的表達水平在NPC組織中顯著上調，而MAD2L1、MCM7、CCNB2、CCND2、BUB1、BUB1B的表達水平在兩種組織中沒有明顯變化，見表5。

2.4 Western blot驗證 Western blot檢測NPC組織中和鼻炎黏膜組織中CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白的表達水平，結果發現CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1在NPC組織中表達顯著上調，見圖1。

Tab.2 Primer information表2 引物信息

Tab.3 GO analysis of differential expression genes表3 差異表達基因的GO分析

Tab.4 KEGG signal pathway analysis of differential expression genes表4 差異表達基因的KEGG信號通路分析

3 討論

病毒感染、遺傳因素和環境因素均與NPC的發病過程有關。例如，EB病毒編碼的LMP1蛋白可以通過抑制LKB1-AMPK通路促進NPC上皮細胞的惡性轉化［6］。研究發現，基因LOC344967啟動子區的單核苷酸多態性（32G/A）可以在其轉錄調控區域形成一個AP-1蛋白的結合位點，進而導致LOC344967的異常表達，并參與NPC的惡性轉化進程［7］。此外，吸煙可以促進EB病毒的復制，并誘導轉錄因子Zta和Rta的異常表達，從而促進NPC的發生發展［8］。因此，在分子水平上研究NPC的發病機制，找到NPC的潛在治療靶點尤為重要。

本研究在GEO數據庫中篩選出2套關于NPC的基因芯片數據，通過生物信息學分析，找到了18個與細胞周期相關的基因在NPC組織中表達異常升高。這些基因中部分已經被廣泛研究。例如，SKP2是F-box蛋白家族成員，該蛋白是cyclin A-CDK2 S期激酶的必要元件。SKP2在S期可以特異性地識別磷酸化的CDKN1B，并且可以與SKP1相互作用，參與細胞周期的調控［9-10］。Wang等［11］發現SKP2在NPC組織中表達顯著升高，而且與不良預后相關。敲低SKP2的表達可以抑制細胞增殖，促進細胞衰老，抑制細胞干性和自我更新能力。Feng等［12］發現，用姜黃素處理NPC細胞系CNE1和CNE2，可以通過上調miR-7的表達，進而抑制其靶蛋白SKP2，并最終促進NPC細胞周期停滯，抑制細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。CHEK1基因編碼的蛋白屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，該蛋白可以整合來自ATM和ATR（涉及DNA損傷反應的兩種細胞周期蛋白）的信號，參與DNA損傷引起的細胞周期停滯。此外，CHEK1還可以通過誘導CDC25A蛋白磷酸酶的磷酸化，參與雙鏈DNA斷裂引起的細胞周期延滯［13］。Liu等［14］發現，用EA6（一種草藥提取物）處理NPC細胞系CNE1，可以使其細胞周期停滯在G2/M期。這種EA6誘導的細胞周期停滯作用可以在CHEK1敲低后被逆轉，說明CHEK1可能是EA6抑制NPC細胞增殖的一個新的分子靶標。Mak等［15］報道，用CHEK1的小分子抑制劑（AZD7762）和WEE1的小分子抑制劑（MK-1775）同時處理NPC細胞，可以誘導NPC細胞的有絲分裂障礙，進一步說明CHEK1可能是NPC治療的一個潛在治療靶點。CDK4基因編碼的蛋白屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，是蛋白激酶復合物的催化亞單位。CDK4的活性由調節亞基D型細胞周期蛋白和CDK抑制劑p16（INK4a）調控，而且CDK4的生物學活性僅局限于G1/S期，對細胞周期G1期進展至關重要［16］。Chen等［17］注意到CDK4可以通過破壞細胞周期來調控腫瘤的進程，而且CDK4的高表達是NPC不良預后的潛在標志物。Jiang等［18］注意到CDK4蛋白可以同時在細胞核與細胞漿中表達，而CDK4的核表達水平越高的患者（尤其是T1～2期、N2～3期以及臨床分期為Ⅲ期或Ⅳ期的NPC患者），其生存期越短。此外，抑制CDK4在NPC細胞中的表達可以觀察到癌細胞的生長和細胞周期進程受到抑制，與此同時，NPC細胞中CCND1、CDK6和E2F1的表達受到抑制，p21的表達上調［19］。

Tab.5 Real-time PCR analysis of mRNA expression levels of 18 genes in two kinds of tissues表5 Real-time PCR檢測18個基因在2種組織中的mRNA表達水平 （n=5，±s）

Tab.5 Real-time PCR analysis of mRNA expression levels of 18 genes in two kinds of tissues表5 Real-time PCR檢測18個基因在2種組織中的mRNA表達水平 （n=5，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01

TTK 0.92±0.13 2.29±0.13 7.580＊＊1.55±0.22 1.29±0.33 0.672組別鼻炎黏膜組織NPC組織t鼻炎黏膜組織NPC組織t CDC6 0.95±0.15 3.98±0.44 6.491＊＊0.94±0.07 3.18±0.09 19.450＊＊CDK1 1.08±0.09 2.36±0.22 5.276＊＊0.89±0.12 2.38±0.34 4.086＊＊SKP2 1.17±0.07 3.69±0.78 3.203＊0.91±0.04 3.85±0.57 5.107＊＊CHEK1 1.03±0.06 2.94±0.60 3.180＊1.39±0.15 1.23±0.38 0.388 MCM2 0.83±0.05 2.89±0.54 3.755＊＊1.36±0.09 1.33±0.08 0.282 CDK4 0.89±0.04 2.41±0.18 8.056＊＊1.40±0.12 2.22±0.22 0.997 MCM4 1.13±0.13 3.01±0.60 3.028＊1.31±0.15 1.25±0.08 0.379 CCNB1 0.98±0.06 2.88±0.45 4.174＊＊1.39±0.17 2.90±0.90 1.634

Fig.1 Western blot analysis of protein expression levels of CDC6,CDK1,MCM2 and CCNB1 in two kinds of tissues圖1 Western blot檢測NPC組織和鼻炎黏膜組織中CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白的表達水平

為了更進一步研究這些基因與NPC發病機制的關系，筆者利用real-time PCR在mRNA水平上檢測18個細胞周期相關基因在NPC組織中與鼻炎黏膜組織中的表達，結果顯示CDC6、CDK1、SKP2、TTK、CHEK1、MCM2、CDK4、MCM4、CCNB1、CDC45、MYC、CCNA2的表達水平在NPC組織中顯著上調。本研究在芯片和real-timePCR中同樣觀察到SKP2、CHEK1和CDK4這3個基因在NPC組織中的高表達，與前述研究一致［11,15,17］，說明本研究數據解讀和定量PCR的可靠性。由于SKP2［11］、TTK［27569188］、CHEK1［15］、CDK4［17］、MCM4［25973099］、CDC45［23584157］、MYC［28586063］、CCNA2［17689134］等基因已經被廣泛研究，最終筆者選取CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1作為研究對象，進一步利用Western blot在蛋白水平上檢測其在NPC組織中與對照鼻炎黏膜組織中的表達，結果發現，CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白在NPC組織中均有不同程度的表達上調，提示這4個基因可能是NPC發生發展的潛在致病因子或治療靶點。

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