由上呼吸道感染誘發的急性點滴型銀屑病皮損生態微生物研究

張寶蘭，王曉萌，常貴珍，張理濤

銀屑病是皮膚科常見的自身免疫性疾病，病因尚不明確，但國際公認感染為誘發點滴型銀屑病的主要原因。既往研究證實，點滴型銀屑病與上呼吸道感染鏈球菌相關［1-2］。銀屑病患者體內存在對鏈球菌反應特異的T淋巴細胞［3］，可促進細胞因子如白細胞介素（IL）-2、IL-6［4］和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等產生，進一步誘導角質形成細胞過度增生，但并不直接影響該細胞DNA的合成［5］。這些研究表明微生物菌群的變化可能與銀屑病發病存在因果關系。皮膚在體表微生物與非特異性免疫的共同作用下建立了適應性免疫［6］，除其本身的物理屏障外［7］，還會分泌抗菌物質如β-防御素、抗菌肽、S100蛋白等［8］來自我保護。本研究采用16SrDNA二代測序技術明確由上呼吸道感染誘發的急性點滴型銀屑病患者皮損處的微生物狀態，并與正常健康體檢者體表微生物比較，以明確2種人群的差異及其組間的物種差異。

1 對象及方法

1.1 研究對象 選取2017年5月—9月于天津市中醫藥研究院附屬醫院門診確診的急性點滴型銀屑病患者（銀屑病組）11例，男3例，女8例，平均年齡（30.18±8.03）歲，病程多為2～4周。同期健康體檢者11例為對照組，男3例，女8例，平均年齡（30.27±8.45）歲。研究對象的一般情況統計見表1。納入標準：2個月內未口服、注射或靜脈滴注任何抗生素及免疫抑制劑等藥物，1周內未使用外用型抗生素制劑，至少24 h內未洗澡，無其他任何疾病、皮膚創傷或其他相關感染。本研究經本院倫理委員會批準且患者均簽署知情同意書。

1.2 樣本收集 使用無菌棉球經無菌水處理后在靶點部位加壓擦拭取材，靶部位包括四肢伸側、腰骶部、腹部，順時針方向擦拭，每個部位至少30 s，收集完畢立即置于-80℃冰箱備用。

1.3 主要試劑及器材 DNA抽提試劑盒購自賽默飛，Phusion?的高保真酶購自新英格蘭生物公司，膠回收試劑盒，TruSeq?DNA PCR-Free樣本制備建庫試劑盒購自凱杰公司，生物樣本均質器、超聲波DNA破碎儀、Illumina測序平臺來自天津諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣本DNA抽提與質檢 樣本經液氮冷凍后進行研磨，使用DNA抽提試劑盒按說明書抽提DNA。取1 g瓊脂糖加入100 mL 1×TAE［TAE是由三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（EDTA）組成的緩沖液］電泳緩沖液配置瓊脂糖凝膠，加入EB染色，取5 μL的DNA抽提液及1 μL的Loading Buffer于加樣孔，電壓100 V、40 min后在紫外燈下觀察。

1.4.2 PCR擴增與文庫構建 取抽提液1 μL，對16SrDNA（16SrRNA為核糖體RNA的一個亞基，16SrDNA就是編碼該亞基的基因，這里單指這個基因）的V4區測序，特異引物：515 F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806 R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。5 μL 10×Buffer、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、1.6 μL Taq 酶、4 μL Primers、37 μL ddH2O，配成50 μL的PCR反應體系。樣本DNA抽提液中最低體積為1 μL。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸130 s，循環35次；72℃延伸10 min。將PCR產物利用磁珠純化兩次后，產物置于2 mL的離心管中。使用Qubit 2.0儀器檢測純化后的PCR質量，質檢通過后委托天津諾禾致源生物信息科技有限公司測序。

Tab.1 Comparison of the general situation of two groups of patients表1 銀屑病患者與健康者的一般情況比較

1.5 統計學方法 （1）物種分布情況。利用Uparse軟件（v7.0.1001）對樣本有效序列進行聚類，并使Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫［9-10］進行物種注釋分析，了解物種分布情況。（2）樣本復雜度分析。QIIME（Version 1.9.1）計算α多樣性指數［Observed_species、香農-威納指數（Shannonwiener diversity index）、辛普森多樣指數（Simpson diversity index）、chao1豐富度估計量（Chao1 richness estimator）、基于豐度的覆蓋估計（Abundance-based Coverage Estimator）］，使用SPSS 24.0進行統計分析2組樣本的物種豐富性與分布情況。（3）微生物結構β多樣性分析。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋性曲線、物種積累箱形圖，主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖，觀察2組間在物種多樣性與微生物群落結構即微生物豐度是否存在差異。構建 UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean）樣品聚類樹。PCoA與UPGMA直觀地描述了樣本間的差異，本研究目的為銀屑病組與對照組間的差異物種，因此選擇非加權距離（unweighted unifrac）進行分析。（4）組間差異物種。用LEfSe軟件進行分析尋找組間差異顯著的物種［11］，為尋找相對豐度較大，起主要作用的物種，把LED值設為4。尋找2組間差異顯著的物種，主要觀察屬水平的差異，利用相對豐度（某一物種豐度與全部微生物物種豐度的比值）進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 物種分布情況 按97%的相似性進行聚類，共得到3 427條OTU序列，對OTU序列進行生物注釋，門、綱、目、科、屬、種水平分別發現40、88、157、306、784、566個種類。按豐度排名前10位的物種繪制累加圖，發現各樣本組成相似，主要為變形菌門（proteobacteria）、放線菌門（actinobacteria）、厚壁菌門（firmicutes），見圖1。銀屑病組與對照組中上述3種菌門的相對豐度（某一菌門豐度/所有菌門豐度）分別為42.38%和34.34%、23.95%和31.44%、25.51%和27.35%。

全部樣本中編號為ZP16的樣本藍藻菌門（cynaobacteria）未分類的葉綠體屬相對豐度水平較其他銀屑病患者高，查看一般情況記錄發現提供此樣本的銀屑病患者為孕婦。為保證結果客觀真實，將處于妊娠期的患者樣本ZP16（很明顯較其他樣本多出許多橙色的條帶，為藍藻菌門）以及離散度較大的樣本N5（在β多樣性分析中，可看到該樣本距離較其他樣本十分遠，且在距離矩陣的數值較其他離散）剔除，銀屑病組與對照組各剩10例樣本，主要物種未發生明顯變化，見圖2。

2.2 樣本復雜度分析 根據此20例樣本繪制的物種積累箱型圖顯示，箱形圖最后趨于平緩，表明樣本量足夠，測序數據合理（圖3）。銀屑病組與對照組的稀釋性曲線顯示，2組在物種多樣性上差異無統計學意義（圖4）。同時2組α多樣性指數差異均無統計學意義，見表2。

2.3 微生物結構β多樣性分析 為了分析皮膚表面菌群的完整性對樣本的分類影響，使用PCoA非加權算法計算樣本分群情況（圖5）。如果不考慮預試驗與正式試驗的差別，銀屑病組與對照組之間存在明顯分群現象，差異較為明顯，患者組樣本聚集在一起（紅色點），對照組樣本聚集在一起（藍色點），整體事件解釋率為29.1%（一般整體解釋率大于20%，即可說明樣本間關系）。這說明在皮膚菌群完整性上，銀屑病組與對照組在皮膚菌相存在不同之處。對整體樣本構建進化樹（圖6），可見除個別樣本可能因為個體特異性聚類分散外，銀屑病組與對照組大部分是分別聚集在一起，樣本聚類情況理想，說明銀屑病皮損與正常皮膚表面微生物存在一定程度的差異。結合樣本一般情況，與聚類樹結果對比發現，ZP8與其他銀屑病患者距離較遠，說明微生物分類與年齡有關，ZP26、ZP27與其他患者樣本分開，說明在男女樣本中年齡相對較小，病程短的患者微生物分布接近對照組。

Fig.3 The accumulation boxplot of species圖3 物種積累箱形圖

Fig.4 The sample rarefaction curves in the two groups圖4 2組樣本稀釋性曲線

Tab.2 Comparison of alpha diversity index between the two groups表2 2組α多樣性指數的比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of alpha diversity index between the two groups表2 2組α多樣性指數的比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05；Shannon為香農-威納指數，simpson為辛普森多樣指數，chao1為chao1豐富度估計量，ACE為基于豐度的覆蓋估計

組別銀屑病組對照組t Observed_species 1 088.10±233.57 1 034.00±161.98 0.602 Shannon 5.81±0.89 5.56±1.18 0.547 simpson 0.92±0.05 0.89±0.13 0.725 chao1 1 340.33±240.27 1 295.93±295.19 0.369 ACE 1 373.83±239.27 1 333.86±285.88 0.339

Fig.5 PCoA analysis based on Unweighted Unifrac distance for each sample圖5 各樣本基于Unweighted Unifrac距離的PCoA分析

2.4 組間差異物種 銀屑病組與對照組在屬水平主要物種的相對豐度分別為葡萄球菌屬13.02%、15.10%，棒狀桿菌屬9.66%、15.97%，棲水菌屬8.65%、4.89%，不動桿菌屬9.82%、2.89%，未知的葉綠體0.27%、2.04%，鏈球菌屬3.38%、2.70%，副球菌屬2.34%、2.53%，丙酸桿菌屬3.16%、5.81%。LEfSe分析（LED閾值為4）在銀屑病組與對照組間篩選出具有顯著性差異的物種為不動桿菌屬（圖7）。2組不動桿菌屬和未分類的葉綠體這2種物種組間差異均有統計學意義，見表3。

Fig.7 The LEfSe analysis cladogram and the LDA value distribution histogram圖7 LEfSe分析進化分支圖和LDA值分布柱狀圖

Tab.3 Comparison of significant different species in acinetobacter and unidentified chloroplast between two groups表3 銀屑病組與正常對照組具有顯著差異物種不動桿菌屬與未分類葉綠體的相對豐度比較 ［n=10，M（P25，P75）］

3 討論

目前，有關尋常型銀屑病皮損微生物的研究尚無定論。有研究顯示，銀屑病與正常健康對照者存在鏈球菌、丙酸桿菌的顯著差異［12］。另有研究顯示，棒狀桿菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌在銀屑病組與對照組間存在相對豐度的差異，但僅限于描述性分析［13-14］。以上研究的銀屑病對象可能因人種、病程不同或在前期治療中使用抗生素制劑而使表皮菌群重新分布有關，但都表明銀屑病發病的確與皮損微生物的變化相關。

本實驗運用16SrDNA測序技術對樣本分析，所得數據進行α多樣性分析發現銀屑病組與對照組差異無統計學意義。β多樣性分析中，對樣本聚類分析示，PCoA與UPGMA聚類樹結果多數樣本都表現出銀屑病組與對照組在微生物群落結構上有所不同。LEfSe分析與秩和檢驗結果發現不動桿菌在2組中有差異。不動桿菌屬革蘭陰性桿菌，黏附力極強，對生長環境要求較低，廣泛分布于自然界、醫院環境及健康人的皮膚表面［15］。其黏附在皮膚上成為潛在的致病菌原因之一是可以產生神經氨酸酶，后者在后續細菌黏附宿主的作用中發揮作用，可形成細菌生物膜，促進細菌微生物的定植［16］。有研究證實，皮膚表面微生物菌種的變化無論個體差異多大，均受到不動桿菌等相對豐度變化的影響，如金黃色葡萄球菌（SA）豐度隨不動桿菌豐度升高而升高，丙酸桿菌則與之為負相關［17］。本研究檢測到銀屑病組不動桿菌相對豐度升高即符合這一現象。筆者推測在上呼吸道感染時，機體免疫力降低可導致不動桿菌感染，或因鏈球菌的作用致使體表微生物尤其不動桿菌相對豐度發生了改變。由于本研究病例均為初發或復發的患者，病程較短，體表生態微生物一般正在發展到另一個相對穩定的狀態中。研究顯示，由于微生物間的相互作用持久，而且這種微生物間相互作用可正可負，不一定處在同一種穩定狀態［18］；這種穩態的改變就像陸地森林生態系統一樣，由一個物種的變化即可導致其他物種的生長或消亡［19］，這種變化過程需要一定時間，且相互作用會持續存在。因此，短期病程內物種菌群還未凸顯差異，皮損區與健康皮膚微生物在α多樣性分析中沒有太大差異，但β多樣性分析圖顯示2組間微生物菌相有所差異。

具有顯著差異的不動桿菌在微生物菌群相對穩態變化時可起到樞紐作用。不動桿菌介導致病菌如SA形成新的生物膜，而SA的毒力作用使IL-17等炎癥因子釋放增加［20］；IL-17在T細胞炎癥軸線及角質形成、細胞過度增生的過程中起到重要作用，可導致銀屑病加重［21］。另外，不動桿菌本身具有致病性，可在上呼吸道感染期接收信號，作用皮膚，激活T淋巴細胞，產生細胞因子，并且刺激皮膚產生大量抗菌肽、防御素、S100蛋白等殺菌物質，促使銀屑病的發生，此點也證實了微生物穩態對宿主的健康十分重要。

前期物種數據比對結果發現，銀屑病組中有1例藍藻菌門，葉綠體豐度較高，此患者在確診銀屑病后檢查發現已妊娠，因此急性點滴型銀屑病妊娠患者與其他患者皮損微生物物種存在差異還是偶發情況有待考證。然而，剔除已妊娠患者的樣本后進行數據分析發現，該物種在健康對照組中較銀屑病組相對豐度較高，藍藻釋放毒素對皮膚具有刺激性，卻在健康對照組中有較高的豐度，該結果具有什么意義，目前還不明了，需要進一步研究論證。

本次實驗突出的最主要問題是測序。筆者將預試驗樣本的測序結果與后期樣本的測序結果進行統一分析，發現因測序批次的不同，樣本聚類可能會有所偏差，如PCoA分析圖，預試驗與正式試驗樣本分離，但僅正式試驗部分表示2組間是存在差異的。當下，人們關注自身衛生的同時存在“過度清潔”，濫用抗生素的現象，有可能導致自身免疫性疾病的發生。若發生此類與自身免疫性相關炎癥性疾病，可考慮應用益生菌制劑來穩定微生物穩態，阻斷由微生物菌群變化導致皮膚免疫反應的發生，以控制炎癥的發展。

（圖1、2、6見插頁）

Fig.1 The schematic diagram of mechanical loading for a mouse圖1 小鼠機械加載圖示

Fig.2 The schematic diagram of whole body composition analyzer for a mouse圖2 小鼠體成分分析圖示

Fig.3 The body sizes of mice before being sacrificed圖3 小鼠處死前體型

Fig.4 General observation of liver tissues in three groups of mice圖4 小鼠肝臟組織肉眼觀察

Fig.5 The changes of hepatic adipocytes under light microscopy in three groups(HE staining,×200)圖5 各組小鼠肝臟脂肪細胞光鏡下觀察（HE染色，×200）

Fig.6 The changes of liver tissues under light microscopy in three groups(Oil red O staining,×200)圖6 各組小鼠肝臟組織光鏡下觀察（油紅O染色，×200）

［1］Telfer NR，Chalmers RJ，Whale K，et al.The role of streptococcal infection in the initiation of guttate psoriasis［J］.Arch Dermatol，1992，128（1）：39-42.

［2］Talanin NY.American academy of dermatology 1998 awards for young investigators in dermatology detection of streptococcal antigens in psoriasis［J］.J Am Acad Dermatol，1998，39（2 Pt 1）：270-271.

［3］張理濤，陳學榮，殷金珠.β溶血型鏈球菌誘發點滴型銀屑病發病機制的研究［J］.中華皮膚科雜志，1999，32（2）：29-30.Zhang LT，Chen XR，Yin JZ.Study on pathogenesis of guttate type psoriasis induced by group a β-haemolyticstreptococcal infection［J］.Chin J Dermatol，1999，32（2）：29-30.

［4］張理濤，高興華，陳洪鐸，等.鏈球菌抗原刺激的銀屑病患者外周血單一核細胞培養上清液中TNF-α和IL-6的檢測［J］.中華皮膚科雜志，2000，33（5）：58.Zhang LT，Gao XH，Chen HD，et al.Detection of TNF-α and IL-6 in the culture supernatant of peripheral blood mononuclear cells from patients with psoriasis stimulated by streptococcus antigen［J］.Chin J Dermatol，2000，33（5）：58.

［5］張理濤，閻學貞，夏青，等.鏈球菌抗原和幾種細胞因子對人類角質形成細胞株DNA合成的影響［J］.中國皮膚性病學雜志，2000，14（6）：383-384.Zhang LT，Yan XZ，Xia Q，et al.Effect of streptococcus antigen and several cytokines on the compose of human keratinocyte strain DNA［J］.Chin J Derm Venereol，2000，14（6）：383-384.

［6］Yang JJ，Chang TW，Jiang Y，et al.Commensal staphylococcus aureus provokes immunity to protect against skin infection of methicillin-resistant staphylococcus aureus［J］.Int J Mol Sci，2018，19（5）.pii：E1290.doi：10.3390/ijms19051290.［Epub ahead of pirint］.

［7］Yuki T，Yoshida H，Akazawa Y，et al.Activation of TLR2 enhances tight junction barrier in epidermal keratinocytes［J］.J Immunol，2011，187（6）：3230-3237.doi：10.4049/jimmunol.1100058.

［8］Gallo RL，Nakatsuji T.Microbial symbiosis with the innate immune defense system of the skin［J］.J Invest Dermatol，2011，131（10）：1974-1980.doi：10.1038/jid.2011.182.

［9］Wang，Q，Garrity GM，Tiedje JM，et al.Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（16）：5261-5267.doi：10.1128/AEM.00062-07.

［10］Quast C，Pruesse E，Yilmaz P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project：improved data processing and web-based tools［J］.Nucl Acids Res，2013，41（Database issue）：D590-D596.doi：10.1093/nar/gks1219.

［11］Segata N，Izard J，Waldron L，et al.Metagenomic biomarker discovery and explanation［J］.Genome Biol，2011，12（6）：R60.doi：10.1186/gb-2011-12-6-r60.

［12］Gao Z，Tseng CH，Strober BE，et al.Substantial alterations of the cutaneous bacterial biota in psoriatic lesions［J］.PLoS One，2008，3（7）：e2719.doi：10.1371/journal.pone.0002719.

［13］Alekseyenko AV，Perez-Perez GI，De Souza A，et al.Community differentiation of the cutaneous microbiota in psoriasis［J］.Microbiome，2013，1（1）：31.doi：10.1186/2049-2618-1-31.

［14］Fahlen A，Engstrand L，Baker BS，et al.Comparison of bacterial microbiota in skin biopsies from normal and psoriatic skin［J］.Arch Dermatol Res，2012，304（1）：15-22.doi：10.1007/s00403-011-1189-x.

［15］Ramalingam K，Lee VA.Antibiofilm activity of an EDTA-containing nanoemulsion on multidrug-resistant Acinetobacter baumannii［J］.Artif Cells Nanomed B，2018，May 2：1-7.doi：10.1080/21691401.2018.1468771.［Epub ahead of print］

［16］Prakasam G，RohitA，PadmasiniE，etal.Production of neuraminidase in relation with biofilm formation among clinical and healthy skin isolates of Acinetobacter species［J］.Indian J Med Microbiol，2014，32（4）：459-460.doi：10.4103/0255-0857.142235.

［17］Leung MHY，Tong X，Wilkins D，et al.Individual and household attributes influence the dynamics of the personal skin microbiota and its association network［J］.Microbiome，2018，6（1）：26.doi：10.1186/s40168-018-0412-9.

［18］Blaser MJ，Kirschner D.The equilibria that allow bacterial persistence in human hosts［J］.Nature，2007，449（7164）：843-849.doi：10.1038/nature06198.

［19］Jackson CR.Changes in community properties during microbial succession［J］.Oikos，2003，101（2）：444-448.

［20］Howell MD，Boguniewicz M，Pastore S，et al.Mechanism of HBD-3 deficiency in atopic dermatitis［J］.Clin Immunol，2006，121（3）：332-338.doi：10.1016/j.clim.2006.08.008.

［21］Hawkes JE，Chan TC，Krueger JG.Psoriasis pathogenesis and the development of novel targeted immune therapies［J］.J Allergy Clin Immunol，2017，140（3）：645-653.doi：10.1016/j.jaci.2017.07.004.