牛胎兒骨骼肌來源成肌細胞分化相關microRNA的篩查與鑒定

邢義珅，胡 鑫，任 玲，王亞慧，徐凌洋，李俊雅，張路培(中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

肉用動物的肌肉產量主要由肌纖維數量和截面直徑直接決定[1]。胎兒期是動物骨骼肌發育的關鍵時期，出生后個體骨骼肌的發育主要表現為肌纖維的增大，而肌纖維的數量基本上不再增加[2]。因此，研究胎兒期的骨骼肌發育，對于肉用家畜來說具有非常重要的意義。在哺乳動物的骨骼肌發育過程中，多種細胞信號分子和轉錄因子參與了肌細胞的增殖和分化[3]。除此之外，microRNA(miRNA)作為一類重要的非編碼RNA，通過其序列、結構、豐度和轉錄方式的多樣性，在骨骼肌發育等許多生物過程中調控基因表達[4]。

miRNA是一類在真核生物中廣泛表達的內源性小分子單鏈RNA，成熟后長度在22個核苷酸左右[5]。miRNA通過與靶向mRNA的3′UTR區域進行特異性的堿基互補配對，引起靶向mRNA的降解或轉錄活性穩定下降，抑制其翻譯，從而在轉錄后層面抑制基因的表達[6-7]。研究發現，miRNA能夠參與機體的多種生命活動，包括細胞增殖分化和凋亡、新陳代謝、疾病發生、干細胞自我更新以及腫瘤發生等[8-12]。隨著研究的深入，人們對miRNA調控骨骼肌發育的理解也越來越透徹，現在已經發現眾多的miRNA廣泛地作用于控制細胞成肌分化的相關基因，對成肌分化產生重要影響[13]。miR-1抑制HDAC4的表達，促進非洲爪蛙肌細胞分化[4]；miR-27b可以抑制Pax3的表達，從而抑制小鼠胎兒細胞進入骨骼肌發育的過程[14]；miR-206能夠作用于多個與肌肉分化相關的基因來影響動物肌肉的發育[15-16]；miR-125b能夠作用于IGF-II，抑制成肌細胞的分化[17]等。

關于牛肌肉發育的miRNA已經有一些報道[18]，但大都停留在成體水平，關于胎兒骨骼肌分化相關miRNA動態變化的研究鮮有文獻報道。本研究采用高通量測序技術，對牛胎兒來源的骨骼肌細胞分化始末差異表達miRNA進行篩查與鑒定，挖掘與牛胎兒期肌肉發育相關的miRNA，同時，采用熒光定量PCR技術驗證測序結果的可靠性，為后續研究牛胎兒骨骼肌發育提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 成肌細胞 試驗細胞來源于3頭4月齡的牛胎兒背最長肌組織。試驗動物相關操作符合實驗動物管理條例(國家科學技術委員會，2017第3次修訂)，母牛屠宰后取出子宮，迅速帶回中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所分子生物學實驗室，用于分離培養成肌細胞。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ⅳ型膠原酶購自Sigma公司；低糖DMEM、胎牛血清、馬血清、青鏈霉素雙抗和胰酶購自Gibco公司；TRIzol Reagent購自Invitrogen 公司； miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit購自天根生化科技(北京)有限公司。熒光定量PCR儀為ABI Q7。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞分離和培養 用75%的乙醇對子宮進行消毒處理，用手術剪剪開子宮取出牛胎兒。用手術刀剝開胎兒背部皮膚，取背最長肌組織置于PBS中。

取約200 mg肌肉組織置于1.8 mL離心管中，用眼科剪將其剪成1 mm3大小的肉糜，加入1 mg·mL-1的IV型膠原酶(溶于低糖DMEM培養基)1 mL，放入37 ℃恒溫空氣浴搖床中進行消化，每隔15 min取出離心管，用移液器進行吹打。消化45 min后取出離心管，先用孔徑為100 μm的尼龍網篩過濾，再用孔徑為40 μm的尼龍網篩過濾，得到含有單細胞的懸液，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液后得到細胞沉淀，加生長培養基(10%胎牛血清+89% L-DMEM+1%青鏈霉素雙抗)后接種于培養皿中。

原代成肌細胞融合度達到約70%時，用0.25%的胰酶消化傳代，將細胞接種到細胞培養板中，每2 d更換1次培養基，在細胞融合度達到100%時，收取0 d的樣品，同時將其它細胞更換為分化培養基(5%馬血清+94% L-DMEM+1%青鏈霉素雙抗)，每2 d更換1次培養基，培養成肌細胞至分化終末，收取樣品于-80 ℃冰箱內保存。

1.2.2 總RNA的提取、質量檢測及測序文庫的建立 依照TRIzol試劑說明書的操作步驟來提取總RNA，用分光光度計測定總RNA的濃度和純度。取總RNA進行電泳，檢驗所提取總RNA的完整性。利用Aglient 2100對樣品濃度精確定量。RNA樣品總量、濃度、RIN值、OD260 mm/OD280 mm都符合標準后，按照Small RNA Sample pre Kit說明書步驟構建測序文庫。

1.2.3 測序數據的生物信息學分析

1.2.3.1 文庫上機測序和數據的預處理： 用illumina MiSeq高通量測序平臺對構建好的文庫進行測序，然后對測序數據進行質量評估。原始數據文件經過堿基識別分析轉化為原始測序序列，分別去除低質量(質量值Q≤5的堿基數占整個read的50%以上的reads)、有5′接頭污染、沒有3′接頭序列、沒有插入片段、長度小于18 nt的reads，去除poly A的reads，最終得到clean reads。

1.2.3.2 序列分析和統計： 統計得到clean reads在長度上的分布，將clean reads與Rfam(v10.0)數據庫進行比對，統計rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA及tRNA的比例，去除5類ncRNA(non-coding RNAs)后，再與牛基因組(Bos_Taurus_Ensembl_release-80/Bos_taurus.UMD3.1)進行比對，統計比對到基因組sRNA(small RNAs)的數量。用mirDeep2(v2.0.0.5)軟件檢測已知miRNA。用去除了5類ncRNA的sRNAs與miRbase(v19.0)數據庫進行比對，檢測已知miRNA，并統計表達量。

1.2.3.3 差異表達miRNA的分析及其靶基因預測： 根據得到的成熟miRNA在各個文庫中的表達量，用edgeR(v3.20.1)軟件進行miRNA的差異表達分析，得到成肌細胞分化始末差異表達的miRNA。依據miRNA與其靶位點的互補性、miRNA靶位點的保守性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩定性及附近序列的二級結構等原則，綜合利用miRanda(v3.3a)和RNAhybrid來預測靶基因，統計差異表達miRNA的靶基因。用topGO(v2.30.0)軟件對差異表達miRNA對應的靶基因進行富集分析。

1.2.4 反轉錄和qPCR驗證 為了驗證測序結果的準確性，隨機選取8個表達量較高的差異表達miRNA，分別檢測其在成肌細胞分化始末的表達量。以U6作為內參，分別根據miRNA的序列設計熒光定量PCR的上游引物，下游引物由試劑盒提供(未列出)，引物信息見表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR201)說明書進行逆轉錄，合成miRNA對應的cDNA第一鏈。熒光定量PCR按照miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP411)說明書進行。反應體系為20 μL：2×miRcute增強型miRNA定量預混試劑(含SYBR和ROX)10 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，正向引物 (10 μL)0.4 μL，cDNA 2 μL，無核酶ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環。

表1RT-PCR正向引物序列

Table1RT-PCRforwardprimersequences

引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequencebta?miR?148a?FCGCCTCAGTGCACTACAGAACTTTGbta?miR?1?FCGCCGTGGAATGTAAAGAAGTATGTATbta?miR?34a?FCGTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTbta?miR?7?FCGCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTbta?miR?27a?5p?FAGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCAbta?miR?26a?FCGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGCTbta?miR?199a?5p?FCGCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTbta?miR?143?FGGTTGAGATGAAGCACTGTAGCTCGbta?U6?FCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATbta?U6?RGCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT

1.2.5 數據統計 用SPSS 19.0軟件的t檢驗對數據進行顯著性分析，試驗數據用“平均值±標準誤”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 牛胎兒骨骼成肌細胞培養及總RNA提取

用膠原酶消化法從4月齡的牛胎兒骨骼肌中分離成肌細胞，可以看到單個細胞呈纖維狀，形態比較一致，將細胞接種于培養皿中，約2 d后細胞融合度達到70%，傳代至六孔細胞培養板中，每孔接種細胞約為1×105個，待細胞長滿后(圖1A)更換誘導培養基進行誘導分化，5 d后(圖1B)可以看到，大量細胞融合形成長條狀的肌管，肌管受到冷刺激時，可以進行有節律的舒縮運動，表明肌管成熟，成肌細胞分化至終末階段。

提取總RNA，分光光度計檢測顯示，總RNA OD260 mm/OD280 mm>1.8，OD260 mm/OD230 mm>2.0，電泳結果顯示總RNA完整性良好(圖略)，無明顯降解。

圖1 牛胎兒骨骼肌來源的成肌細胞分化0(A)和5 d(B)的明場照片(標尺：100 μm)Fig.1 Bright field pictures of myoblasts isolated from bovine fetal skeletal muscle differentiated on 0(A) and 5 d(B)(bar: 100 μm)

2.2 測序結果及數據處理

2.2.1 高通量測序數據 將得到的數據進行過濾，去除污染和低質量序列后，得到序列的基本信息見表2。統計6個sRNA文庫中的所有序列長度分布，大部分序列集中分布在21～24 nt，形成主峰。其中，長度為22 nt的序列頻率最高，其次為23 nt的序列(圖2)。

Clean reads與Rfam數據庫進行比對，將比對到數據庫中的sRNA進行注釋，結果見圖3。miRNA所占的比例分別為37.39%和42.41%。

表2各文庫測序基本情況

Table2Generalinformationaboutlibraries

樣品名Samplename總數Totalreads高質量序列數Cleanreads所占比例/%PercentageA0d155870051313915584．33A5d134035971180047088．08B0d152866101291049484．49B5d119509431000487683．75C0d150856401193093679．12C5d143179451255903787．75

圖2 小RNA的長度分布Fig.2 Length distribution of sRNAs

圖3 成肌細胞分化0(A)和5 d(B)的小RNA分類注釋Fig.3 Annotation of sRNAs of myoblasts differentiated on 0 (A) and 5 d (B)

2.2.2 miRNA序列比對與統計 將過濾后的reads與牛的參考基因組比對，6個文庫的比對結果見表3。其中，比對到基因組的序列比例都在70%以上，比對到基因組的sRNA種數都高于55%。

再將過濾后的reads與miRbase數據庫比對，用mirDeep2軟件進行統計，檢測到成熟miRNA共619個。

表3文庫中sRNA基因組比對結果

Table3GenomicalignmentofsRNAsfromlibraries

樣品名Samplename序列種類UniquesRNAs總數Totaluniquereads比對上的序列數Matcheduniquereads百分比/%Percentage序列數TotalsRNAs總數Totalreads比對上的序列數Matchedreads百分比/%PercentageA0d18245411889265．169258913864328993．35A5d1457868466358．079056538780365986．17B0d19018211963162．906552517547334983．53B5d1308237195755．007025041554293178．90C0d16529810153761．434852204361402474．48C5d1426908441559．1610264886884547786．17

2.3 牛胎兒成肌細胞分化始末差異表達miRNA的分析

統計在不同樣本間成熟miRNA的表達情況，用edgeR軟件進行成肌細胞分化始末差異表達miRNA的分析，設定閾值P-value為0.05，Fold-change為2，得到差異表達的miRNA共 150個，表達量最高的20個見表4。

熱圖結果顯示，成肌細胞分化0和5 d時，miRNA分別聚類到兩個不同的類群，表明成肌細胞分化始末表達的miRNA有顯著的差別(圖4)。

2.4 差異表達miRNA靶基因預測及靶基因的GO與KEGG通路分析

綜合利用miRanda和RNAhybrid兩款軟件進行差異表達miRNA的靶基因預測，150個差異表達miRNAs共預測到8 821個靶基因。

GO分析結果表明，差異表達miRNA的靶基因在生物學過程中主要參與了機體代謝和細胞代謝過程，占到靶基因總數的63.5%，其次是參與調控細胞生物學質量、細胞增殖分化和RNA轉錄等；在分子功能上，靶基因主要作用于蛋白質結合、酶催化和陰離子結合等；在細胞組成中，靶基因產物主要集中位于細胞內部，分別位于細胞質、細胞器膜和細胞核等(圖5)。KEGG通路分析結果表明，差異表達miRNA的靶基因主要集中在MAPK信號通路、鈣離子信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、縫隙連接和TRP通道介導的炎癥調節過程等(圖6)。

圖4 差異表達miRNA的熱圖Fig.4 Heat map of differentially expressed miRNAs

2.5 qPCR對高通量測序準確性的驗證

隨機選取8個差異表達的miRNAs，進行熒光定量PCR驗證，測序和熒光定量PCR得到的相對表達量如圖7所示。可以看到，兩種結果顯示，miRNA的變化趨勢完全一致，其中bta-miR-148a、bta-miR-143、bta-miR-1、bta-miR-34a、bta-miR-26a、bta-miR-199a-5p在分化5天的表達水平顯著升高，bta-miR-7、bta-miR-27a-5p在分化5天的表達水平顯著降低。熔解曲線都為單峰，引物特異性良好。

3 討 論

當前，二代測序技術已經非常成熟，其通量高和信息量大的特點使其被廣泛應用于畜禽基因組學研究中[19]。本研究利用illumina測序平臺，對牛胎兒骨骼肌來源的成肌細胞miRNA進行高通量測序，鑒定已知miRNA 619個，分化始末差異表達miRNA共150個。對于高通量測序結果隨機選取8個表達量相對較高的差異表達miRNAs，用加Poly A尾的方法合成cDNA，并用熒光定量PCR技術來檢測miRNA的表達量，檢測結果與測序結果完全一致，表明了測序結果具有較高的準確性和可靠性。這些結果將為后續研究miRNA和成肌細胞分化的工作提供試驗依據。

miRNA是表觀遺傳學研究的重要內容之一，其通過作用于mRNA來抑制靶基因的表達[19-20]。胎兒肌肉的發育對肉牛出生后的表型會產生極為重要的影響，然而目前人們對miRNA在牛胎兒骨骼肌發育過程中的角色并不完全清楚[21]。通過對牛胎兒成肌細胞體外培養分化過程中差異表達miRNA的鑒定，能夠更好的理解骨骼肌發育的機制。

miRNA廣泛存在于各個物種，并且具有一定的保守性，這為驗證試驗得到的miRNA提供了一定的參考[22]。在鑒別出的差異表達miRNA中，有一些已經在牛或其它物種肌肉的相關研究中有過報道。miR-199a-5p可以通過靶向作用于WNT2，調節平滑肌細胞的增殖和分化，在平滑肌肥大和器官重塑上有潛在的應用價值[23]。Zuo等[24]對豬肌肉miRNA表達譜分析后發現，miR-143通過HDAC4-MEF2通路調控MYH7的表達，進而影響肌纖維的類型，miR-1可以影響肌球蛋白的含量、肌纖維的類型和肌肉性能。miR-26a在C2C12細胞系、小鼠和人的原代骨骼肌細胞成肌分化過程中表達量都呈上升趨勢，這與本研究結果一致[25]。miR-26a通過作用于轉錄因子Smad1和Smad4，調控TGF-β/BMP信號通路，促進肌細胞分化，給乳鼠注射miR-26a的特異性拮抗物，能夠抑制乳鼠骨骼肌的分化[25]。miR-148a在C2C12細胞分化過程中表達上升，其靶向作用于ROCK1基因從而促進肌原細胞分化[26]。在正常細胞內過表達miR-148a可以促進肌原細胞的分化，同時使細胞周期停滯。用干擾劑抑制miR-148a的表達時，C2C12分化被抑制，MHC和MyoG表達量顯著下降[26]。

表4高表達的差異表達miRNAs

Table4ThedifferentiallyexpressedmiRNAswithhighexpressionlevel

微小RANmicroRNAP值P?value錯誤檢出率FDRA5dTPM值A5d＿TPMB5dTPM值B5d＿TPMC5dTPM值C5d＿TPMA0dTPM值A0d＿TPMB0dTPM值B0d＿TPMC0dTPM值C0d＿TPMbta?miR?21?5p2．53E?050．0005362200321746082375771694996537828335bta?miR?199a?5p0．0025280．014098422853159143873335652326114721bta?miR?199a?3p1．11E?067．62E?0529100195672540910027101065590bta?miR?199c1．45E?067．89E?0529100195662540810027101065590bta?miR?1430．0026160．0142411743719049210721542676168483bta?let?7f0．0037960．018309106117158105541156339471730bta?miR?424?5p0．0007720．00600310161511312364849733431590bta?miR?3780．0091150．0343852814322144288859119297927bta?miR?1360．0016010．010163654679559555821532032077bta?miR?26a0．0019520．011807809849259584631442662158bta?miR?148a1．20E?067．62E?05118385151946343841151371bta?miR?199b0．0100430．03625524126794596420125561483bta?miR?2210．0052080．022808159011721739632235402819bta?miR?320a0．0054040．022992152614601442394448553695bta?miR?1520．0002920．00358336362844335031311174515bta?miR?10．0008940．006627145596363981827880189bta?miR?3810．0019040．01169813249513732177128685bta?miR?30a?5p0．000140．0020571499196122561560578168bta?miR?26b0．0030870．01625191972921951619623303bta?miR?30d0．0022930．0134391353131216751393752394

圖5 差異表達miRNA預測靶基因的GO分析Fig.5 Gene Ontology analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

圖6 差異表達miRNA預測靶基因的KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

不同miRNAs表達量間相比，*. P<0.05,**. P<0.01*.P<0.05,**.P<0.01 among expression levels of miRNAs

圖7 miRNA的測序及qPCR檢測結果Fig.7 Expression of miRNAs quantified by sequencing and qPCR

KEGG通路分析表明，本研究篩選的差異表達miRNA的靶基因富集到了多個與肌肉發育相關的通路。如p38 MAPK信號通路是參與骨骼肌發育的重要調控通路。MAPK能夠激活轉錄因子MyoD基因和MEF2家族成員的表達，促進成肌分化[27]。鈣離子信號通路對骨骼肌的生成、穩態維持和再生至關重要，鈣離子有可能對肌衛星細胞產生直接作用，控制其處于靜止狀態或是增殖分化成為不同功能的肌肉[28]。細胞炎性因子TNF-α能夠通過作用于p38 MAPK抑制骨骼肌的分化[29]。用TNF-α處理人成肌細胞，細胞miRNA的表達受到了影響，進而影響到多個細胞進程，最終對肌管形成產生抑制作用[30]。IGF-1/Akt信號通路在骨骼肌生長過程中發揮著核心作用，能夠促進蛋白質合成、增加肌肉量[31]。美國康乃狄克州的研究人員發現，瞬時電位通道(TRP channels)的增多促進了心肌的纖維化，鈣離子通透型的瞬時電位通道可能成為治療心肌纖維化的新靶點[32]。瞬時電位通道可能與心肌肥大和心律失常相關[33]。將C2C12細胞培養在極低頻率磁場中，細胞的間隙連接增加，C2C12融合和分化的速度加快，可能為肌肉功能紊亂找到新的治療方法[34]。

基于上述已有研究，可以看到測序結果中的部分miRNA對成肌細胞分化的影響已經被印證，但是肌肉發育是一個復雜的過程，涉及到非常復雜的基因表達調控網絡的變化，所以miRNA在其中的作用機制還有很多待挖掘的地方。并且，miRNA在物種之間存在一定的差異，牛的物種特異性的調控機制也有待進一步研究。因此，本試驗結果將為以后的相關研究提供重要的參考。

4 結 論

本研究通過高通量測序和生物信息學分析，鑒定出了150個在牛胎兒骨骼肌來源的成肌細胞分化過程中差異表達的miRNAs，這些miRNAs有可能參與了牛胎兒期骨骼肌的分化。靶基因預測和功能分析表明，差異表達miRNA可能在動物肌肉發育相關的細胞信號通路中起作用，為進一步研究miRNA調控家畜骨骼肌發育奠定理論基礎。

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