雷公藤內酯醇抑制TNF-α表達對小鼠潰瘍性結腸炎的影響*

張海峰，張彬，周國雄，陳衛昌

（1.南通大學附屬醫院，江蘇 南通 226001；2.蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006）

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）主要促炎因子。研究表明，TNF-α在UC血清、局部組織中的表達明顯升高[1-7]。雷公藤內酯醇（Triptolide，TL）是從中藥雷公藤中分離的二萜內酯化合物，具有抗炎、免疫調節作用[8-17]。本實驗應用TL治療UC小鼠，觀察治療前后小鼠的病情變化，以及TL與疾病的相關性，進一步明確TL是否對UC有療效，以及是否與抑制TNF-α的表達有關。

1　材料與方法

1.1　材料

選擇4～6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠80只，由南通大學動物實驗中心提供，在南通大學動物實驗中心動物房按常規方式喂養。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt,DSS）（美國 MP Biomedicals公司），TL（中國南京澤郎醫藥科技有限公司），Trizol抽提RNA試劑（美國Invitriogen公司），PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），TNF-α多克隆抗體（兔抗小鼠，美國Abcam公司），二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。本實驗已通過南通大學附屬醫院醫學倫理委員會審批。

1.2　方法

1.2.1動物模型的復制按STEVCEVA[18]和張艷麗等[19]的方法復制DSS實驗動物模型，除空白對照組外，其他組小鼠飲用5% DSS溶液（5g DSS溶于100 ml蒸餾水）7 d。

1.2.2實驗分組將80只雌性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美莎拉嗪組，以及TL 1、2、3組8組，分籠飼養，每籠10只。空白對照組：不予任何處理；生理鹽水組：DSS模型復制成功后腹腔注射生理鹽水0.2 ml/次，1次/d；丙二醇組：腹腔注射20%丙二醇0.2 ml/次，1次/d；地塞米松組：地塞米松0.1 mg/（kg·d）溶于生理鹽水中腹腔注射；美沙拉嗪組：美沙拉嗪20～30 mg/kg溶于水中經胃管注入，3次/d；TL 1組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為0.20 mg/（kg·d）；TL 2組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為0.40 mg/（kg·d）；TL 3組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為 0.60 mg/（kg·d）。

1.2.3疾病活動指數（disease activity index,DAI）評分各組從第1天開始，每日觀察、記錄小鼠的一般情況，包括精神、活動、飲食、體重變化，同時觀察小鼠的大便性狀及便血情況，分析治療前后結腸病變的變化。參照MURANO等[20]的標準進行DAI評分（見表1）。DAI=（體重下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3。大便性狀分數分為：①正常大便，可成型顆粒樣大便；②松散便，不與肛門相黏的糊狀糞便或半成形不黏肛便；③稀便，黏于肛門的水樣便。大便隱血檢測采用傳統聯苯胺法。

1.2.4大體形態學評分模型復制成功后第8天，采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，分離整段結腸組織并縱行剖開結腸，預冷生理鹽水沖洗清潔數次，用濾紙濾干，大頭針展開平鋪，固定結腸組織。用肉眼觀察結腸黏膜炎癥及潰瘍發生情況，參照EKSTROM等[21]的標準進行評分：黏膜無損害計0分，黏膜充血計1分，潰瘍面積＜25%受損面積計2分，潰瘍面積占25%～50%受損面積計3分，潰瘍面積＞50%受損面積計4分。將病變明顯腸段分為3部分：一部分用4%甲醛固定，送病理科，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色；一部分于 -80℃條件下保存，留做逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）； 另一部分提取蛋白，留做Western blot檢測。

表1　DAI評分標準

1.2.5結腸病理組織學觀察及評分取病變組織常規石臘包埋、切片、HE染色，參照BOIRIVANT等[22]的標準行盲法評分，由2位病理科醫師分別雙盲閱片，結果取均值進行評分。組織學評分標準：正常計0分；極低白細胞浸潤、＜10%高倍視野（high power field,HPF）計1分；少量白細胞浸潤、10%～25% HPF計2分；中量白細胞浸潤、25%～50% HPF，同時伴血管密集和腸壁增厚計3分；大量白細胞浸潤、＞50% HPF、血管高度密集、隱窩變形、扭曲計4分。

1.2.6酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）收集血液，3 000 r/min離心 10 min，將血清與紅細胞分離；3 000 r/min離心30 min取上清，3 000 r/min離心10 min去除顆粒和聚合物。操作步驟：在室溫下平衡20 min后從鋁箔袋中取出所需板條，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔加入不同濃度的標準品50μl/孔；樣本孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μl/孔，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50μl，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值。結果判斷：繪制標準曲線，在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.2.7RT-PCR取適量病變組織提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，行PCR擴增。TNF-α正向引物：5’-CCTCAGGAACGGGACTCGAA-3’，反向引物：5’-ATGTACACCAAGTCGGTAGCACCA-3’，擴增片段長度86 bp；內參照β-actin正向引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，反向引物：5’-CCACAGGATTCCATACCCAA-3’，擴增片段長度446 bp。PCR反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火25 s，72℃延伸35 s，共循環45次，于每個循環的72℃時采集熒光數值。為檢測每個反應的特異性，循環結束后分析熔解曲線，分析條件為95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s。為消除樣本、逆轉錄和PCR反應的差異，以目的基因TNF-α 和β-actin mRNA含量的比值作為評價目的基因表達水平的指標。

1.2.8Western blot檢測提取總蛋白，用紫外分光光度法測定總蛋白濃度，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白上樣量20μl/孔。在垂直電泳槽中電泳后轉膜至硝酸纖維素膜上，5% TBST封閉4 h，加入稀釋的TNF-α一抗（工作濃度1∶2 500）4℃孵育過夜；TBST洗膜10 min/次，共5次，加入稀釋的二抗（工作濃度1∶5 000）孵育2 h，用增強化學發光熒光試劑顯影。以β-actin（47 kDa）為內參照，用凝膠成像分析系統處理數據，以TNF-α（17 kDa）與內參照的灰度比值作為蛋白的相對表達量。

1.3　統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較采用重復測量設計的方差分析或單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　實驗動物觀察

各組小鼠從開始處理后7 d內每天固定時間評估各組小鼠DAI評分，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的DAI評分有差別（F=37.841，P=0.000）；②各組 DAI評分有差別（F=55.512，P=0.000）；③各組DAI評分變化趨勢有差別（F=29.662，P=0.000）。空白對照組小鼠精神狀態、活動、飲食等一般情況良好，大便性狀正常，體重逐步增加。生理鹽水組、丙二醇組小鼠模型復制成功后第1、2天開始飲食減少、活動能力下降，毛色無光澤、體重減少，同時排便次數逐漸增多，大便性狀發生改變（軟便、稀糊狀、水樣便等）；第3、4天大便隱血或出現暗紅色、鮮紅色血便。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，生理鹽水組、丙二醇組小鼠DAI評分與空白對照組比較，差異有統計學意義（t=22.368和24.526，均P=0.000）。TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組在復制模型的同時給予相應治療后，各組小鼠精神狀態好轉，活力明顯增加，飲食及體重較生理鹽水組、丙二醇組下降幅度減少，毛色有改善，便血或大便隱血情況明顯好轉，部分大便形態逐漸恢復為軟便或者固體便；TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組小鼠DAI評分與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（t=9.226、8.880、7.582和8.006，均P=0.000）；TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組小鼠DAI評分與丙二醇組比較，差異有統計學意義（t=11.228、10.663、10.002和 9.445， 均P=0.000）。結果顯示，TL與地塞米松、美莎拉嗪有類似效應，能改善UC小鼠的一般情況。見表2。

表2　各組小鼠不同時間DAI評分比較（n=10，分，±s）

表2　各組小鼠不同時間DAI評分比較（n=10，分，±s）

組別　1 d　2 d　3 d　4 d　5 d　6 d　7 d空白對照組　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000生理鹽水組　0.292±0.213　0.417±0.154　1.083±0.661　2.167±0.563　3.000±0.642　3.750±0.345　4.002±0.560丙二醇組　0.333±0.000　0.333±0.000　1.000±0.356　2.292±0.602　2.917±0.345　3.708±0.452　4.120±0.602地塞米松組　0.292±0.118　0.292±0.118　0.500±0.436　0.917±0.556　1.617±0.427　2.083±0.345　2.475±0.330美沙拉嗪組　0.292±0.118　0.302±0.120　0.625±0.336　1.017±0.502　1.717±0.489　2.223±0.405　2.575±0.410 TL 1 組　0.250±0.236　0.333±0.178　0.708±0.415　1.542±0.469　2.417±0.345　3.375±0.415　3.875±0.173 TL 2 組　0.250±0.154　0.333±0.178　0.416±0.345　1.325±0.575　1.708±0.603　2.308±0.547　2.917±0.345 TL 3 組　0.333±0.000　0.333±0.000　0.483±0.167　1.417±0.569　1.867±0.793　2.217±0.631　2.767±0.272

2.2　各組小鼠結腸大體形態學評分比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠結腸大體形態學評分分別為（0.300±0.100）、（3.206±0.306）、（3.022±0.282）、（1.826±0.168）、（1.968±0.204）、（2.632±0.282）、（2.202±0.228）和（2.060±0.202）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=30.360，P=0.000）。空白對照組大部分小鼠結腸黏膜無充血、糜爛及潰瘍，少部分結腸黏膜見少許散在充血。生理鹽水組、丙二醇組小鼠直腸及近肛側結腸黏膜彌漫性充血、水腫，伴多發性糜爛、淺表潰瘍，部分潰瘍表面有壞死組織；近口側結腸充血水腫、散在糜爛，無明顯潰瘍形成。地塞米松、美莎拉嗪治療組，以及TL 2、3組小鼠近肛側結腸黏膜輕、中度充血，水腫，糜爛形成較生理鹽水組、丙二醇組明顯減少，部分散在淺潰瘍；近口端結腸病變不明顯。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸大體形態學評分比較，差異有統計學意義（t=25.532和25.731，均P=0.000）；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸大體形態學評分比較，差異有統計學意義（t=7.442和6.396，均P=0.000）；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸大體形態學評分比較，差異有統計學意義（t=8.840和7.844，均P=0.000）。TL能減輕UC小鼠結腸炎癥。見圖1。

圖1　各組小鼠結腸大體形態學評分比較（n=10，±s）

2.3　各組小鼠結腸病理組織評分比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠結腸病理組織評分分別為（0.750±0.100）、（3.562±0.326）、（3.488±0.302）、（1.666±0.192）、（1.802±0.224）、（2.808±0.282）、（2.020±0.222）和（1.862±0.206）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=22.358，P=0.000）。HE染色結果顯示，空白對照組小鼠結腸上皮結構、腺體結構完整無破壞，黏膜無糜爛及潰瘍形成，部分黏膜下層可見少量中性粒細胞浸潤；生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸黏膜上皮結構破損，見糜爛及潰瘍形成，黏膜及黏膜下層可見大量的淋巴細胞和單核細胞、少量中性粒細胞浸潤，固有層腺體變形、排列紊亂，部分破壞；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組小鼠結腸黏膜可見數量不等淋巴細胞和單核細胞浸潤，糜爛及潰瘍程度較生理鹽水組、丙二醇組減輕。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸病理組織評分比較，差異有統計學意義（t=23.325和24.344，均P=0.000）；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸病理組織評分比較，差異有統計學意義（t=11.058和11.078，均P=0.000）；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結腸病理組織評分比較，差異有統計學意義（t=12.469和12.581，均P=0.000）。TL具有減輕UC小鼠結腸局部病變損害的作用。見圖2。

2.4　各組小鼠血清TNF-α濃度比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠血清 TNF-α濃度分別為（173.332±18.288）、（388.302±30.202）、（341.322±31.202）、（195.620±18.208）、（231.408±22.608）、（338.36±18.931）、（243.526±23.462）和（197.066±20.108）pg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=80.681，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義（t=17.221和13.138，均P=0.000），生理鹽水組和丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度較高；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義（t=10.707和7.086，均P=0.000），TL 2組小鼠血清TNF-α濃度較低；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義（t=14.908和10.992，均P=0.000），TL 3組小鼠血清TNF-α濃度較低；地塞米松組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義（t=15.454和11.408，均P=0.000），地塞米松組小鼠血清TNF-α濃度較低；美沙拉嗪組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統計學意義（t=11.763和8.068，均P=0.000），美沙拉嗪組小鼠血清TNF-α濃度較低。TL能降低UC小鼠血清TNF-α濃度。

2.5　各組小鼠TNF-α mRNA表達水平比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠TNF-α mRNA相對表達量分別為（1.000±0.000）、（2.332±0.366）、（2.422±0.342）、（1.228±0.142）、（1.426±0.150）、（2.022±0.320）、（1.602±0.202）和（1.582±0.182），經方差分析，差異有統計學意義（F=19.500，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（t=10.294和11.760，均P=0.000），空白對照組TNF-α mRNA微弱表達，生理鹽水組和丙二醇組TNF-α mRNA表達上調；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（t=4.939和5.839，均P=0.000），TL 2組較低；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（t=5.190和6.133，均P=0.000），TL 3組較低。TL可抑制UC小鼠局部組織中TNF-α mRNA過表達。見圖3。

圖2　各組小鼠病理組織學圖片（HE染色×200）

圖3　各組小鼠TNF-α mRNA表達水平比較（n=10，±s）

2.6　各組小鼠TNF-α蛋白表達水平比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠TNF-α蛋白相對表達量分別為（0.020±0.010）、（0.063±0.020）、（0.058±0.018）、（0.028±0.013）、（0.029±0.013）、（0.046±0.018）、（0.032±0.015） 和（0.030±0.014），經方差分析，差異有統計學意義（F=57.301，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，生理鹽水組、丙二醇組與空白對照組小鼠TNF-α蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（t=5.439和5.220，均P=0.000），空白對照組小鼠TNF-α蛋白微弱表達，生理鹽水組、丙二醇組TNF-α表達上調；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組與生理鹽水組小鼠TNF-α蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（t=4.150、4.032、3.507 和 3.823，P=0.004、0.002、0.001和0.001），地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組TNF-α蛋白表達水平較生理鹽水組降低；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組與丙二醇組小鼠TNF-α蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（t=3.822、3.694、3.139 和 3.473，P=0.002、0.002、0.007和0.004），地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組TNF-α蛋白表達水平較丙二醇組降低。TL可抑制UC小鼠局部組織中TNF-α蛋白的合成。見圖4。

圖4　各組小鼠TNF-α蛋白的表達

3　討論

TL具有廣泛的免疫調節作用，但由于作用機制的廣泛性及機體免疫系統的復雜性，其免疫調節機制并不十分清楚。就目前研究結果可知，其作用機制主要有抑制T細胞增殖或誘導T細胞凋亡、影響NF-κB活性、抑制腫瘤血管生成、抗氧化和抗脂質氧化等[8-17]。

張霞等[16]研究表明，TL可以抑制MOG35-55特異性T細胞增殖，抑制炎癥細胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的表達，并增加IL-4、TGF-β的表達水平，同時抑制Nave T細胞向致病性Th1和Th17細胞的分化。蘭雷等[17]研究表明，用TL對三硝基苯磺酸/乙醇性腸炎的大鼠模型進行處理，發現TL可減輕該模型的組織學損傷，下調促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1及黏附因子ICAM-1的表達水平；同時檢測相應的NF-κB活性發現，治療組較模型組明顯受抑，提示TL能抑制NF-κB活化，從而使NF-κB調控的炎癥介質產生減少，大鼠結腸組織損傷減輕。周鋆等[23]在復制UC大鼠模型的基礎上，以雷公藤紅素進行干預，發現高、低劑量雷公藤紅素均能改善結腸組織大體和組織學評分，降低NF-κB、p65，以及TNF-α和TNF-αmRNA的表達，表明雷公藤紅素對TNBS誘導的大鼠UC具有保護作用。TAO等[24]研究表明，TL可抑制結腸上皮下肌纖維母細胞內IL-8、MCP-1、MMP-3的表達而發揮抗炎效應，其作用機制主要是抑制IL-1β誘導的NF-κB激活。TAO等[25]另一項研究結果表明，TL可以減少TNBS誘導的UC模型小鼠結腸細胞外基質的沉積，以及減少膠原蛋白的產生，從而抑制結腸纖維化病變程度。YU等[26]研究顯示，TL可明顯改善實驗小鼠結腸炎癥狀，作用機制可能是抑制TLRs/NF-κB信號通路，認為TL可作為Crohn's病的治療方法之一，值得深入研究。LI等[27]研究表明，TL可以通過下調IL-6/STAT3/SOCS3信號通路抑制IL-17表達；組織學檢查結果顯示，C3H/HeJBir.IL-10缺失老鼠實驗結腸炎癥狀明顯改善。WEI等[28-29]研究表明，給予TL可以明顯減輕IL-10缺失小鼠結腸炎的炎癥程度和免疫功能紊亂，其機制可能是抑制IL-6/STAT3、TNF-α/TNFR2信號通路，認為TL可能適用于Crohn's病的維持治療。本實驗前期研究結果表明，分別通過TL、地塞米松治療DSS誘導的UC小鼠，發現TL能減輕小鼠臨床癥狀，并下調次級淋巴組織趨化因子的表達，提示TL可通過抑制SLC的過表達，而達到治療UC的目的[30]。

本研究結果驗證，TNF-α在UC的發生、發展中發揮重要作用，抑制其過表達對UC有治療作用。同時發現TL 2、3組在給予TL治療后，各組小鼠體重增加，一般情況好轉，DAI評分、大體形態觀察及評分、病理組織觀察及評分均提示小鼠結腸炎癥狀緩解，結腸組織局部潰瘍、糜爛好轉，結果提示TL對UC有治療作用，其療效不低于有地塞米松、美沙拉嗪。同時發現給予TL治療后，血清TNF-α濃度下降，局部結腸組織中TNF-α在mRNA和蛋白水平表達均下調，提示TL有抑制TNF-α過表達的作用。筆者認為TL具有抑抑制炎癥的作用，對UC有治療作用，可通過抑制TNF-α的過表達而發揮療效，但其具體作用機制仍不明確。進一步明確TL在UC中的作用機制，將對UC的治療，特別是對激素、美沙拉嗪類藥物療效欠佳的UC患者帶來新希望。

綜上所述，TL對UC有治療作用，可能是通過抑制TNF-α的過表達而發揮作用，提示TL可能是一種有效的治療UC的方法。