β連環蛋白對腦膠質瘤輻射抗性的影響

高力揚，李錦宏，陳兵，楊帆，岑學程，廖壯檳，龍霄翱，王思捷

（1.寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021；2.廣東醫科大學附屬醫院 神經外科，廣東 湛江 524001；3.廣東醫科大學附屬醫院 臨床研究中心，廣東 湛江 524001）

膠質瘤占腦部惡性腫瘤的60%，世界衛生組織神經系統腫瘤分級將其分為低級別和高級別，高級別膠質瘤中位生存時間只有10～15個月。膠質瘤主要的治療手段是最大安全范圍內手術切除腫瘤[1]。由于膠質瘤具有侵襲性的自然特性，手術治療后必須行放化療。放射治療致力于控制或者殺滅術后殘留的腫瘤細胞，而化學藥物治療帶來的損傷和腫瘤輻射抗性影響其療效[2]。目前研究發現一些細胞信號通路可能參與膠質瘤輻射抗性[3-6]。因此研究膠質瘤輻射抗性產生的機制對當前臨床治療有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

細胞增殖檢測試劑盒（cell counting Kit-8,CCK-8）（上海碧云天生物技術研究所），IWR-1-endo抑制劑（美國Selleck Chemicals公司），雙抗含青霉素、鏈霉素購于美國Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium,DMEM）購于美國Gibco公司，巢蛋白（Nestin）、β微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、CD133及Ki-67抗體購于北京中杉金橋公司。德國Leica公司的DMI3000B熒光顯微鏡、日本電子株式會社的JEM-1400+GATAN CCD832投射電子顯微鏡由廣東醫科大學附屬醫院臨床研究中心提供，瑞典Eleketa公司的直線加速器由廣東醫科大學附屬醫院放療科提供。

1.2　方法

1.2.1U87細胞系的培養及誘導人腦膠質瘤U87細胞株復蘇后，加入含有雙抗（青霉素50μ/ml，鏈霉素50 mg/ml）和10% FBS的DMEM高糖型培養基懸浮細胞，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養。待細胞進入對數培養期后，取1/3細胞進行傳代培養，或者取1×106個細胞加入1 ml凍存液（80%完全培養基+100μl FBS+100μl二甲基亞砜）于-80℃超低溫冰箱中短期凍存。用濃度為5μmol/L的Wnt信號通路抑制劑IWR-1-endo處理細胞2 d，收集細胞用于后續檢測。

1.2.2細胞增殖實驗采用CCK-8檢測細胞增殖情況。消化收集對照組、照射組和IWR-1-endo聯合照射組細胞，調節細胞密度為15 000個/ml，取100μl細胞培養于96孔板中。48 h后，每孔加入10μl CCK-8，放置于細胞培養箱培養2～4 h，測定450 nm處吸光度值，并利用細胞生長曲線計算各組貼壁細胞數。

1.2.3平板克隆形成實驗0.25%胰蛋白酶分別消化對照組、照射組和IWR-1-endo聯合照射組，將3組細胞分別計數，按500個/皿的密度接種細胞于60 mm培養皿中，靜置培養1周。待培養皿中出現肉眼可見的克隆時，無水甲醛固定細胞30 min，除去固定液后加入結晶紫染色10 min，用流水溫和洗脫染色液，倒置干燥培養皿。肉眼計算細胞克隆數，以克隆形成率表示細胞生長情況，克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.4細胞免疫熒光染色將細胞接種于24孔板培養，IWR-1-endo處理2 d后，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗細胞，4%多聚甲醛固定30 min，10%聚乙二醇辛基苯基醚通透后加入10%羊血清的封閉液處理30 min，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h后加入4，6-聯脒-2-苯基吲哚核染，于DMI3000B熒光顯微鏡下觀察拍照。Nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、CD133及Ki-67抗體用于人膠質瘤U87細胞的鑒定。

1.2.5細胞放療抵抗實驗采用直線加速器X射線照射，照射劑量率為4 Gy/min。取對數生長期細胞，于100 mm培養皿中培養48 h后進行放射實驗。實驗分為對照組和照射組，照射組照射劑量為4 Gy。照射后更換細胞培養液，12 h后收集細胞進行檢測。

1.2.6透射電鏡4%異丙酮固定細胞后環氧樹脂包埋切片，甲苯胺藍染色，銅網法JEM-1400+GATAN CCD832投射電子顯微鏡觀察細胞。

1.2.7蛋白提取取培養48 h后細胞，添加1 mmol/L苯甲基磺酰氟的細胞裂解液裂解細胞，并用細胞刮刀收集裂解液于1.5 ml離心管中。充分溶解后，10 319 r/min離心5 min，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。

1.3　統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　人腦膠質瘤U87細胞的鑒定

為驗證U87細胞具有神經干細胞、神經元及神經膠質細胞等多種特性，而且有較強的增殖活性，筆者選取神經上皮干細胞標志物Nestin、神經膠質細胞標志物GFAP、神經元標志物β-tubulin Ⅲ、干細胞和膠質瘤標志物CD133及增殖細胞相關核抗原Ki-67對人腦膠質瘤U87細胞進行鑒定（見圖1）。

2.2　輻射處理后U87細胞中β-catenin的表達

分別提取照射組和對照組細胞中的蛋白，用Western blot檢測細胞中β-catenin的表達，并使用Image J軟件進行灰度分析。對照組β-catenin蛋白相對表達量為（0.414±0.012），照射組β-catenin蛋白的相對表達量為（0.097±0.003），經t檢驗，差異有統計學意義（t=24.420，P=0.000），照射組β-catenin蛋白相對表達量降低（見圖2）。

2.3　抑制β-catenin對細胞輻射抵抗的影響

用5μmol/L濃度的IWR-1-endo處理U87細胞進行輻射實驗。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，對照組細胞數為（195 200±5 100）個，IWR-1-endo聯合照射組細胞數為（94 234±3 394）個，兩組比較，差異有統計學意義（t=16.790，P=0.000），IWR-1-endo聯合照射組U87細胞增殖能力減弱（見圖3A）。照射組、對照組及IWR-1-endo聯合照射組細胞增殖個數比較，差異有統計學意義（F=673.700，P=0.000）。進一步組間兩兩比較，經LSD-t檢驗，對照組與照射組細胞數比較，差異有統計學意義（t=32.260，P=0.000），對照組與IWR-1-endo聯合照射組細胞數比較，差異有統計學意義（t=30.080，P=0.000），照射組與IWR-1-endo聯合照射組細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。照射組和IWR-1-endo聯合照射組比對照組U87細胞增殖個數少。而照射組和IWR-1-endo聯合照射組的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖 3B）。

圖1　人腦膠質瘤U87細胞的鑒定

圖2　對照組和照射組細胞中 β-catenin的表達

平板克隆實驗顯示，IWR-1-endo聯合照射組的細胞克隆形成率為（0.360±0.050）%，對照組細胞克隆形成率為（0.770±0.110）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.513，P=0.005），IWR-1-endo聯合照射組細胞克隆形成率降低（見圖3C）。照射組、對照組及IWR-1-endo聯合照射組細胞克隆形成率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=46.810，P=0.0002）。進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，對照組與照射組細胞克隆形成率比較，差異有統計學意義（t=9.589，P=0.002），對照組與 IWR-1-endo聯合照射組細胞克隆形成率比較，差異有統計學意義（t=5.915，P=0.010），照射組與IWR-1-endo聯合照射組細胞克隆形成率比較，差異有統計學意義（t=3.674，P=0.035）。照射組和IWR-1-endo聯合照射組比對照組的U87細胞克隆形成率低，而IWR-1-endo聯合照射組的細胞克隆形成率比照射組高（見圖3D）。

電鏡結果顯示，對照組線粒體成橢圓形，雙層膜及線粒體嵴較清晰（見圖4A）；高劑量X射線照射后，U87細胞線粒體腫脹，形狀接近圓形，外膜較完整，但中央為細粒狀物質或大空泡（見圖4B）；但IWR-1-endo聯合照射組在經過X射線照射后，部分線粒體形狀較正常，只有少量腫脹呈圓形，中央為細粒狀物質或大空泡（見圖4C）。經X射線照射的細胞內線粒體腫脹嚴重，嵴幾乎完全消失（見圖4B）；而經X射線照射的IWR-1-endo聯合照射組中，細胞內線粒體形狀較為完好（見圖4C）。提示IWR-1-endo可能通過抑制β-catenin的表達，起到保護細胞線粒體的作用。

圖3　各組細胞增殖、克隆形成率比較（±s）

圖4　3組透射電鏡圖

3　討論

射線對細胞的直接影響來源于輻射能量干擾細胞的氧化防御體統，細胞中活性氧增多，最終導致細胞DNA損傷[7]。然而，細胞會通過改變基因表達、改變細胞因子表達量等方式對輻射產生抗性[8-11]。在本研究中，受到高劑量X射線照射的U87細胞中β-catenin蛋白表達量降低，提示細胞中β-catenin的表達變化可能與輻射有一定關系。β-catenin是具有多種功能的蛋白，在細胞黏附和基因轉錄中發揮重要作用，并且在β-catenin在有絲分裂過程中參與促進中心體分離[12]。細胞中β-catenin的累積受有糖原合成酶激酶3β、Axin蛋白參與的多種蛋白組成的破壞復合體的影響，被破壞復合體磷酸化β-catenin進一步被蛋白酶體水解[13]。因此穩定破壞復合體或誘導其組成蛋白，可以促進β-catenin的磷酸化和降解，從而減少細胞中β-catenin的累積。為了驗證此推論，筆者選取IWR-1-endo來抑制細胞中β-catenin。IWR-1-endo是一種Axin蛋白激活劑，可以降低細胞中β-catenin的表達量。隨著β-catenin的降低，受輻射的細胞表現出輻射抵抗的現象，如細胞增殖和克隆形成率增高等。CCK-8細胞增殖檢測可以靈敏、快速檢測活細胞數量變化；而細胞平板克隆實驗可以反應細胞貼壁后的存活率及增殖活力，反應了細胞群體依賴性和增殖2個重要性狀，用于評估輻射對細胞的亞致死性損傷情況。結果顯示，在未經輻射照射前，IWR-1-endo可以抑制細胞增殖和克隆形成率，說明此條件下β-catenin表達降低，對U87增殖和存活能力起到抑制作用。但經IWR-1-endo處理的細胞在接受輻射后，增殖細胞數和平板克隆形成率呈增加的趨勢。以上結果顯示，β-catenin表達降低對細胞抵抗輻射傷害可能有保護作用。透射電鏡結果發現，β-catenin表達降低的細胞在接受輻射后，線粒體結構較對照組相對完整，線粒體形態較正常。提示β-catenin表達降低可能通過保護線粒體來抵抗輻射引起的細胞凋亡，從而起到保護作用。以往研究發現，電離輻射引起內源性自由基增多，其作用位點主要為線粒體膜、DNA及蛋白質，對線粒體轉膜功能、mtDNA的斷裂和堿基突變、ATP合成等都有直接影響，因此線粒體是電離輻射誘導的凋亡的主要靶點[14-15]。線粒體形態與細胞凋亡有密切聯系，線粒體從管狀向點狀表型的轉換是細胞凋亡的表現，線粒體嵴重塑和開放與細胞色素C介導的細胞凋亡有關[16]。綜上所述，β-catenin表達量的降低能維持輻射后細胞中線粒體形態，這個作用可能與細胞對輻射損傷的抵抗有關。