DC-CIK細胞誘導宮頸癌細胞凋亡的研究

韋瑋，陳心秋

（1.廣西省柳州市工人醫院 婦產科，廣西 柳州 545005；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，廣西 南寧 530021）

宮頸癌在女性生殖器官類癌癥中占首位，宮頸癌的治愈率低，死亡率高，發病率呈年輕化[1-3]。樹突狀細胞（dendritic cells,DC）-細胞因子激活的殺傷細胞（cytokine induced killer,CIK）混合生物免疫療法作為腫瘤生物治療中最成熟、應用最廣的治療方法，能激活患者自身的免疫系統辨別和殺傷腫瘤細胞，可改善患者的生活質量，延長生存期[4-6]。本文從分子機制探討DC-CIK細胞對宮頸癌細胞（Hela）殺傷及凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

肝素鈉（美國Sigma公司），標準胎牛血清（美國 Gibco公司），1640培養液（美國Gibco公司），二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）（美國Sigma公司），CCK-8、RNA 提 取試劑盒及RNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，粒細胞巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、干擾素-γ（Interferonγ,IFN-γ）、白介素-2（Interleukin-2,IL-2）、白介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白介素-4（Interleukin-4,IL-4）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及CD3單克隆抗體（北京同立海源公司），CD8-PE、CD40-FITC、CD3-PITC、CD8-PerCP及CD56-PE抗體（美國Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Bcl-2、Bax及 c-myc引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1Hela細胞的培養Hela細胞購于中國科學院上海細胞庫，于10%胎牛血清和1%抗生素的1640培養基，37℃、5%二氧化碳CO2、95%相對濕度培養箱中培養。

1.2.2CIK細胞的培養選取2015年9月于廣西省柳州市工人醫院婦科、腫瘤科未做任何治療的宮頸癌患者58例。每位患者取靜脈血80 ml，加肝素鈉200μl。取50 ml淋巴細胞分離液，分裝10支離心管，每管加8 ml血液，3 000 r/min離心20 min。離心后吸每管上層血清至50 ml離心管，吸取中間層細胞至另一個50 ml離心管中，補加生理鹽水至50 ml，計數并離心（5 000 r/min離心5 min）。取5×107個細胞用于DC細胞的培養，剩余細胞用于CIK細胞的培養，計作第0天，加入IFN-γ（1 000 u/ml）、腺嘌呤核苷三磷酸和20%自體血清。第1天補加IL-2（300 u/ml）、IL-1α（100 u/ml）及CD3單克隆抗體（50 ng/ml），之后根據細胞的數量補加培養基進行擴增。第7天與DC細胞共培養。

1.2.3DC細胞的培養DC細胞的鋪板密度為5×107個/ml，鋪6孔板，2 ml/孔，計作第0天，加入 GM-CSF（1 000 u/ml）和 IL-4（500 u/ml），第 3 天補加DC培養液2 ml，第5天加入抗原，第6天加入TNF-α（500 u/ml）。

1.2.4DC-CIK細胞的培養第8天用巴氏管收集鋪板密度1×107個/ml的DC細胞與1×109數量級的CIK細胞混合共培養，據細胞的數量補加培養基進行擴增，培養的DC-CIK于第10天做微生物檢測，培養第14天用于實驗。

1.2.5DC細胞表型檢測收集5×106個/ml的DC細胞，懸于5 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS），1 000 r/min離心10 min，洗去血清，以PBS調濃度至1×106個/ml，1.5 EP管分裝，分別加入20μl CD8-PE、CD40-FITC，均為鼠抗人單抗，以相應同型抗體為對照，4℃標記30 min，3 ml PBS 1 000 r/min離心10 min，沖洗2次，最后以PBS重懸調濃度至1×106個/ml，用流式細胞儀（FACSria，美國BD公司）檢測。

1.2.6CIK細胞表型檢測收集鋪板密度5×106個/ml的CIK細胞，懸于5 ml PBS，1 000 r/min離心10 min，洗去血清，以PBS調濃度至1×106個/ml，1.5 EP管分裝，分別加入20μl CD3-PITC、CD8-PerCP及CD56-PE一抗，4℃孵育30 min后，PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心10 min，沖洗2次，用PBS重懸細胞調濃度至1×106個/ml，用流式細胞儀檢測。

1.2.7CCK-8選取生長狀態良好的對數生長期Hela細胞，胰酶消化細胞后，接種于96孔板，接種細胞濃度為5×104個/（100μl·孔），將96孔板放入37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中，細胞貼壁培養過夜。分別將100μl 1640完全培養基、培養至第5天的 DC 細胞 [l×105個 /（100μl·孔）]、第 7天的CIK細胞[l×105個/（100μl·孔）]和聯合培養生長 3 d的 CIK-DC 細胞 [l×105個 /（100 ul·孔）]接種于鋪有靶細胞的96孔板，即實驗分組為Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組及Hela+CIK-DC組。培養箱內繼續培養24 h，拿出孔板加入CCK-8試劑20μl/孔，培養箱內孵育2 h，用酶標儀（SpectraMax M4,美國Molecular Devices公司）在450 nm處檢測每孔光密度（optical delnsity，OD）值，取3個平行復孔的平均值。

1.2.8逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）按照 RNA 提取試劑盒說明書提取Hela細胞、CIK細胞和DC-CIK共培養24 h Hela細胞的RNA，并檢測RNA含量。樣品OD260/OD280比值在1.8～2.0，純度較好。逆轉錄反應體系 ：2×TS Reaction Mix（10μl），TransScript RT/RI Enzyme Mix（1μl），Anchored Oligo（dT）18（1μl），Total RNA（500μg），RNase-free Water to 20μl（美國賽默飛世爾科技公司）。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環后，72℃再延伸1 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的RNA表達。采用凝膠成像系統（SA-1000，美國Alpha Innotech公司）進行拍照并分析。GAPDH上游引物：5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，下游引物：5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3；c-myc上 游引物：5-CAGGACTGTATGTGGAGCGGTTTC-3，下游引 物：5-TGCTGTCGTTGAGCGGGTAG-3；Bax上 游引物：5-GTGCACCAAGGTGCCGGAAC-3，下游引物：5-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3；Bcl-2上游引物：5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3，下游引物：5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3。

1.2.9Annexin V/PI雙染取處于對數生長期的Hela細胞，消化重懸細胞后接種于6孔板中，按5×104個/ml的密度培養于2 ml 1640培養液中。待細胞貼壁后加入培養的DC-CIK細胞1×106個培養24 h。倒掉懸浮的DC-CIK細胞，胰蛋白酶適宜時間消化細胞后加入1640培養液（10% PBS）終止消化并離心收集細胞。用PBS洗滌細胞反復離心（2 000 r/min離心5 min）2次，離心后重懸細胞計數，實驗需5×105個細胞。每管按順序依次加入500μl的Binding Buffer，5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI渦旋混勻后。室溫下避光反應15 min。用流式細胞儀檢測。

1.3　統計學方法

數據分析采用SPSS 17.O統計軟件。計數資料以例表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　DC、CIK細胞的形態學觀察

外周血中分離出的單個核細胞貼壁2 h，細胞呈圓形并貼壁，加入IL-4和GM-CSF后細胞形態不規則，懸浮細胞增多，細胞表面有毛刺樣突起生成，且細胞體積變大后開始懸浮生長，分布均勻，具有典型的樹突狀突起。顯微鏡下可見單個核細胞在細胞因子的刺激下，細胞體積開始增加，細胞核逐漸變大，培養至第5天的CIK細胞集落開始聚集生長，后逐漸成簇狀克隆生長。見圖1。

2.2　DC細胞的CD8、CD40的陽性表達

流式細胞儀檢測DC細胞第0和7天時的細胞表面分子CD8和CD40，第0天時CD8的陽性表達率為1.59%，CD40的陽性表達率為2.54%。相對于第0天，第7天時CD8的陽性表達率為21.62%，CD40的陽性表達率為76.67%。第0與7天的CD8與CD40陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=19.555和11.833，均P=0.000），第7天時CD8和CD40的陽性表達率升高。見圖2。

2.3　CIK細胞的CD3、CD8及CD58的陽性表達

流式細胞儀檢測CIK細胞第0和14天時的細胞表面分子CD3、CD8及CD56，第0天時CD3的陽性表達率為37.06%，CD8的陽性表達率為26.36%，CD56的陽性表達率為14.29%。第14天時CD3的陽性表達率為86.85%，CD8的陽性表達率為82.69%，CD56的陽性表達率為47.65%。第0與14天的CD3、CD8及CD56陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=52.113、63.985和 26.028，均P=0.000），第14天時CIK細胞的細胞表面分子CD3、CD8和CD56陽性表達率升高。見圖3。

2.4　DC-CIK細胞對Hela細胞存活率的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DC-CIK組的細胞存活率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，Hela+DC組與Hela組細胞存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明DC細胞不具有腫瘤細胞殺傷能力；Hela+CIK組與Hela組細胞存活率比較，差異有統計學意義（t=22.504，P=0.002），Hela+CIK組比Hela組下降39.72%；Hela+DC-CIK組與Hela組細胞存活率比較，差異有統計學意義（t=34.045，P=0.001），Hela+DC-CIK組比Hela組下降58.40%。見附表和圖4。

圖1　顯微鏡下觀察DC、CIK細胞的形態（×100）

圖2　流式細胞儀檢測DC細胞表面分子CD8和CD40的表達

2.5　DC-CIK細胞對Hela細胞凋亡的影響

Hela組凋亡率為（5.9±3.8）%，與Hela組相比，Hela+DC-CIK組凋亡增加了4.12倍，其凋亡率為（22.0±3.8）%，兩組比較，差異有統計學意義（t=7.851，P=0.001）。見附表和圖5。

2.6　DC-CIK細胞對Hela細胞Bax/Bcl-2 mRNA比值的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DCCIK組的Bax/Bcl-2 mRNA比值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，Hela+DC-CIK組與Hela組的Bax/Bcl-2 mRNA比值比較，差異有統計學意義（t=8.314，P=0.010）。Hela+DC-CIK 組為 Hela組的（3.49±0.08）倍。見附表和圖6。

2.7　DC-CIK細胞對Hela細胞c-myc mRNA表達水平的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DCCIK組的c-myc mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。Hela+CIK組、Hela+DCCIK組與Hela組相比c-myc mRNA表達升高，但Hela+DC-CIK組升高更明顯。Hela+DC-CIK組與Hela組c-myc mRNA水平比較，差異有統計學意義（t=22.079，P=0.000），Hela+DC-CIK組增加了60.72%。見附表和圖7。

圖3　CIK細胞表面分子CD3、CD8和CD56的表達

附表　4組細胞各試驗指標比較

圖4　DC-CIK細胞對Hela細胞存活率的影響

圖5　DC-CIK細胞對Hela細胞凋亡的影響

圖6　DC-CIK細胞對Hela細胞Bax/Bcl-2 mRNA比值的影響

圖7　DC-CIK細胞對Hela細胞c-myc mRNA表達水平的影響

3　討論

DC細胞是機體內具有提呈抗原作用的細胞，成熟的DC細胞表面具有豐富的抗原呈遞分子，DC細胞具有激活T淋巴細胞免疫應答和抵制腫瘤細胞免疫逃逸機制的作用。CIK細胞分泌的抗體與腫瘤細胞表面分子結合，具有較強的殺傷腫瘤細胞的能力，同時具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合體限制性殺瘤優點和T淋巴細胞強大的抗瘤活性，CIK細胞在體外經因子誘導，擴大培養后回輸到癌癥患者體內，顯著提高其免疫活性，也明顯增強其抗腫瘤效果。DC細胞和CIK細胞分別通過不同因子的誘導后共培養，獲得的DC-CIK細胞兼顧DC細胞的抗原遞呈能力和CIK細胞殺瘤能力，發揮高效的抗腫瘤作用。

目前，DC-CIK細胞在其他癌癥的治療中已經取得較滿意的效果。DC細胞與CIK細胞共培養后可有效抑制裸鼠肺腺癌移植瘤組織中血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶及Bcl-2的表達，從而抑制裸鼠肺腺癌移植瘤的生長[7]。DC-CIK免疫細胞治療可以提高固體癌的化療療效以及降低其副作用。在非小細胞肺癌的治療中，與單純化療相比，DC-CIK聯合化療治療晚期非小細胞肺癌不僅安全有效還可以提高緩解率，延長生存期，改善患者的生活質量[8]。臨床上DC-CIK對惡性黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、腸癌及食管癌患者有較好的臨床療效，并能有效增強患者的免疫功能，改善患者的生活質量，提高生存期[9-12]。因此，本研究通過生物學實驗探討DC-CIK細胞對宮頸癌細胞Hela存活率及凋亡的影響，為臨床上DC-CIK細胞治療宮頸癌提供理論依據。

本研究發現，DC-CIK細胞與Hela細胞共培養后，Hela細胞的存活率下降，經Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測后DC-CIK共培養的Hela細胞凋亡和壞死細胞百分比增加。研究表明乳腺癌干細胞抗原負載的DC與CIK細胞作用后誘乳腺癌細胞凋亡，其發生機制與Bcl-2蛋白超家族蛋白表達有關[13]。因此本文進一步檢測了DC-CIK細胞與Hela細胞共培養后Hela細胞促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的變化，結果表明Bax蛋白的mRNA水平升高，而Bcl-2蛋白的mRNA水平降低。c-myc基因是一種可異位基因，也是一種可調節基因。c-myc基因作為癌基因具有雙重作用，不僅參與細胞增殖還參與細胞凋亡，c-myc基因與正調節的生長因子協同促進細胞增殖，而與具有負調控的生長抑制基因如Fas、Fasl及Bas結合后可加速細胞凋亡，在癌癥的發生發展中發揮重要的作用[14]。宮頸癌細胞中c-myc基因高表達，因此本文進一步檢測DC-CIK細胞與Hela細胞共培養后Hela細胞中c-myc基因的影響，RT-PCR結果表明DC-CIK與Hela細胞共培養后Hela細胞內c-myc mRNA水平增加60.72%。本研究表明DC-CIK可通過提高Hela細胞Bax/Bcl-2的比值和c-myc的表達誘導Hela細胞凋亡，這只是DC-CIK細胞誘導Hela細胞凋亡的1個機制，DC-CIK細胞也可能通過釋放其他因子來殺傷Hela細胞，或者通過其他信號通路誘導Hela細胞凋亡，其還有待進一步研究探索。