ABCA1基因R219K多態性對格列美脲療效的影響*

（江蘇大學附屬人民醫院 內分泌科，江蘇 鎮江 212002）

糖尿病是一種常見的內分泌系統疾病。格列美脲是第三代磺脲類降糖藥物[1]。臨床研究發現，其療效存在一定個體差異，遺傳因素（基因多態性）可能是差異的原因之一[2]。有研究表明，三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binging cassette transporter A1,ABCA1）可能是2型糖尿病的候選基因，幾種基因變異均與糖尿病發病相關[3-5]。目前國內未見ABCA1基因R219K多態性與磺脲類藥物療效關系的報道。本研究探討磺脲類藥物個體化差異的遺傳學機制，為制定中國2型糖尿病患者格列美脲的個體化方案提供支持。目前ABCA1基因R219K多態性同磺脲類藥物療效的研究在國內還未見報道。本研究探討磺脲類藥物個體化差異的遺傳學機制，為制定中國2型糖尿病患者格列美脲的個體化方案提供支持。

1　資料與方法

1.1　研究對象

選取2013年10月-2014年9月江蘇大學附屬人民醫院內分泌科門診初診2型糖尿病患者76例，其中67例完成實驗。本研究符合本院人體試驗委員會制定的倫理學標準，實驗對象簽署臨床研究知情同意書。

1.2　納入標準

①漢族；②年齡30～70歲；③各患者間無血緣關系；④能清楚理解并回答問題；⑤符合1999年世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準[6]；⑥連續2次空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）7.0～11.1 mmol/L，而且2次差值≤1.8 mmol/L；或糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）6.5%～10.0%。

1.3　排除標準

①對格列美脲藥物有明顯禁忌證的實驗對象，對其他磺脲類、磺胺類藥物過敏的患者；②應激性高血糖，如外傷、手術等；③1型糖尿病、妊娠糖尿病、繼發性糖尿病或不確定糖尿病類型；④臨床有肝、腎功能損害；⑤心臟異常，如心絞痛、心肌梗死或紐約分級評價Ⅱ～Ⅳ期的心力衰竭；⑥糖尿病伴有急、慢性并發癥；⑦高血壓控制不佳，患者收縮壓（systolic blood pressure,SBP）≥180 mmHg和/或舒張壓（diastolic blood pressure,DBP）≥110 mmHg）；⑧服用可影響糖代謝的藥物，如激素類、噻嗪類藥物等，顯著的消化和吸收障礙；⑨惡性疾病，精神神經系統疾病、自身免疫性疾病、急性腦血管意外后6個月；⑩妊娠、哺乳期婦女。

1.4　方法

1.4.1檢測指標符合納入標準的受試者服藥前檢測其FBG、糖負荷后餐后2 h血糖（2 hour postprandial blood glucose,2 h-BG）、HbA1c。受試者服藥12周后進行隨訪，令患者禁食＞8 h，第2天清晨空腹行100 g標準粉饅頭餐耐量試驗，檢測患者FBG、饅頭餐負荷后2 h-BG、HbA1c。治療前和治療12周后檢測三酰甘油（Triglycerides,TG）、膽固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）。治療前和治療12周后檢測肝、腎功能：谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、 血 肌 酐（serum creatinine,Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）。 以 上指標在江蘇大學附屬人民醫院用全自動生化分析儀Au5800（美國Beckman Coulter公司）進行檢測。

1.4.2藥物劑量給予每位患者格列美脲1 mg/次，1次/d，并根據患者實際血糖水平調整用藥劑量。每1～2周調整1次，直至最大劑量3 mg/d。

1.4.3ABCA1基因R219K多態性分析采用Gentra Puregen Blood Kit人全血基因組脫氧核糖核酸純化提取試劑盒（德國QIAGEN公司）提取DNA。上海捷瑞基因技術有限公司設計引物，正向引物：5’-GGACCCAGCTTCCAATCTTCA-3’，反向引物：5’-GCTGGCTGGGAGTTTGTGAT-3’。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）對目的條帶進行擴增，PCR產物由深圳華大基因科技有限公司測序。

1.5　統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，治療前后比較用配對t檢驗；影響因素的分析用逐步多元線性回歸模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　一般資料

治療前不同基因型患者的年齡、一般臨床生化指標、收縮壓、舒張壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　3種不同基因型患者一般臨床特征比較（±s）

表1　3種不同基因型患者一般臨床特征比較（±s）

組別　年齡 /歲　BMI/（kg/m2）　FBG/（mmol/L）　2 h-BG/（mmol/L）　HbA1c/%　TC/（mmol/L）RR 組（n=24）　48.60±9.94　24.99±3.42　9.72±1.00　15.5±2.07　9.12±0.69　4.98±2.16 RK 組（n=32）　48.31±12.12　25.26±2.84　9.70±1.12　15.62±1.48　9.23±0.74　5.09±1.00 KK 組（n=11）　50.18±13.08　24.52±3.49　9.84±1.32　15.13±1.89　8.85±0.58　4.64±1.05F值　0.082　0.229　0.071　0.323　1.200　0.349P值　0.922　0.796　0.932　0.725　0.308　0.706組別　TG/（mmol/L）　LDL-C/（mmol/L）　HDL-C/（mmol/L）　SBP/mmHg　DBP/mmHg RR 組（n=24）　2.55±1.84　2.72±0.78　1.07±0.23　129.66±11.53　77.83±11.47 RK 組（n=32）　2.63±1.54　3.13±0.88　1.16±0.26　128.65±17.06　81.50±11.71 KK 組（n=11）　2.94±1.27　2.76±0.99　1.00±0.15　132.18±13.41　81.63±7.01F值　0.219　1.756　2.334　0.302　0.842P值　0.804　0.181　0.105　0.740　0.435

2.2　ABCA1基因R219K多態性基因型、等位基因的分布頻率

2.2.1ABCA1基因的R219K多態性基因型RR基因型中的堿基G在KK基因型中變為堿基A，與此同時RR基因的精氨酸（AGG）轉變為KK基因的賴氨酸（AAG）。見附圖。

附圖　部分ABCA1基因 R219K多態性 PCR產物測序

2.2.2ABCA1基因R219K多態性等位基因的分布頻率檢測出ABCA1基因R219K位點基因多態性有3種基因型：RR、RK和KK型，分別為24（38.8%）、32（47.76%）和11例（16.42%），其中等位基因R、K分別為80（59.7%）和54例（40.3%）。采用HWEI 1.20軟件對該基因進行H-W遺傳平衡檢驗，RR、RK和KK型基因的實際值分別為24、32和11，期望值與實際值一致，表明人群ABCA1基因R219K多態性符合群體基因遺傳平衡，具有代表性（χ2=0.004，P=0.952）。

2.3　不同基因型患者血糖、HbA1c比較

不同基因型患者治療12周后FBG、2 h-BG下降，治療12周后3組基因型患者HbA1c較治療前下降（P＜0.05）。各基因型患者治療前FBG、治療后FBG、ΔFBG（治療前后差值）比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療前各基因型患者2 h-BG水平比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療12周后各基因型患者2 h-BG水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，RK、KK基因型患者治療12周后2 h-BG水平低于RR基因型（P＜0.05）。各基因型患者Δ2 h-BG水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，RK、KK基因型患者Δ2 h-BG水平高于RR基因型患者（P＜0.05）。治療前各基因型患者HbA1c水平比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后各基因型患者HbA1c水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，RK、KK基因型患者治療12周后HbA1c水平低于RR基因型患者（P＜0.05）。各基因型患者的ΔHbA1c水平比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4　多元線性回歸分析

以治療12周后2 h-BG水平為因變量，分別以治療前BMI、FBG、2 h-BG、TC、TG、LDL-C、HDL-C的基線水平，以及ABCA1基因型（0：RR；1：RK；2：KK）和格列美脲治療劑量（治療穩定期）為自變量，進行逐步多元線性回歸分析，引入水準≤0.05，排除水準≥0.01。結果顯示，治療前后2 h-BG水平呈正相關（b =0.365，P=0.000）；治療后2 h-BG與ABCA1-R219K基因型呈負相關（b =-0.701，P=0.000）。

以治療12周后Δ2 h-BG為因變量，分別以治療前 BMI、FBG、2 h-BG、TC、TG、LDL-C、HDL-C的基線水平，以及ABCA1基因型（0：RR；1：RK；2：KK）和格列美脲治療劑量（治療穩定期）為自變量，進行逐步多元線性回歸分析，結果顯示Δ2 h-BG與治療前2 h-BG、ABCA1基因R219K多態性呈正相關（b =0.635和0.701，均P=0.000），表明2 h-BG基線水平和ABCA1基因R219K多態性是影響3種基因型治療后2 h-BG水平和Δ2 h-BG變化的因素。

以治療12周后HbA1c水平為因變量，分別以 治 療 前 BMI、FBG、2 h-BG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C的基線水平，以及ABCA1基因型（0：RR；1：RK；2：KK）和格列美脲治療劑量（治療穩定期）為自變量，進行逐步多元線性回歸分析。結果顯示，治療前后HbA1c水平呈正相關（b =0.329，P=0.000）；治療后HbA1c與ABCA1基因R219K多態性呈負相關（b =-245，P=0.001），表明HbA1c基線水平和ABCA1基因R219K多態性是影響3種基因型治療后HbA1c水平的因素。

2.5　不同基因型患者TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較

不同基因型患者各時間TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。格列美脲治療前后患者TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。

表2　不同基因型患者治療前后FBG、PBG及HbA1c水平比較（±s）

表2　不同基因型患者治療前后FBG、PBG及HbA1c水平比較（±s）

注：?與KK組、RK組比較，P＜0.05

FBG/（mmol/L）　2 h-BG/（mmol/L）　HbA1c/%治療前　治療后　差值　治療前　治療后　差值　治療前　治療后　差值RR組（n=24） 9.72±1.00　7.11±0.61　2.61±1.22　15.46±2.07　11.08±1.08?　4.37±1.73?　9.12±0.69　7.16±0.58?　1.95±0.69 RK組（n=32） 9.70±1.12　6.79±0.76　2.90±1.31　15.63±1.48　10.35±1.03　5.27±1.24　9.23±0.74　6.86±0.52　2.36±0.69 KK組（n=11） 9.84±1.32　6.75±0.54　3.09±0.99　15.13±1.89　9.60±1.23　5.52±1.03　8.85±0.58　6.62±0.46　2.23±0.51F值　0.071　1.829　0.678　0.323　7.579　3.679　1.200　4.192　2.597P值　0.932　0.169　0.511　0.725　0.001　0.031　0.308　0.019　0.082組別

表3　不同基因型患者治療前后TC、TG、LDL-C及HDL-C 水平比較（mmol/L，±s）

表3　不同基因型患者治療前后TC、TG、LDL-C及HDL-C 水平比較（mmol/L，±s）

TG治療前　治療后　差值　治療前　治療后　差值RR 組（n=24）　4.98±2.16　4.28±0.92　0.70±1.98　2.55±1.84　1.88±0.97　0.68±1.27 RK 組（n=32）　5.09±1.00　4.75±0.96　0.34±0.96　2.63±1.54　2.17±1.60　0.46±1.60 KK 組（n=11）　4.64±1.05　4.31±1.13　0.33±1.16　2.94±1.27　2.24±2.00　0.70±2.02F值　0.349　1.883　0.496　0.219　0.349　0.179P值　0.706　0.169　0.611　0.804　0.707　0.836 TC組別

續表3

3　討論

2010年對我國成年人開展的一項橫斷面調查表明，糖尿病患病率為11.6%，糖尿病前期患病率為50.1%，這意味著中國成年人中，糖尿病人口多達11 139萬，糖尿病前期人口多達49 340萬[7]。糖尿病的主要危害是其慢性并發癥，達到血糖控制目標可降低糖尿病并發癥發生風險，然而接受降糖治療的糖尿病患者中僅39.7%血糖控制良好[7]。藥物基因組學研究的是不同人群基因組遺傳學差異及其對藥物反應的影響[8]。人們希望通過研究人與人的遺傳差異，預測藥物的療效，從而指導臨床個體化用藥[9-10]。人類的ABCA1基因全長149 kb，定位于9q31，完整的人類ABCA1基因序列包含1 453 bP啟動子、50個外顯子和49個內含子，2者共146 581 bP[11]。ABCA1蛋白的主要功能是脂質的轉運，在高密度脂蛋白膽固醇的合成和膽固醇的逆向轉運中發揮重要作用[12]。有遺傳學證據表明，ABCA1基因與2型糖尿病發病有關。墨西哥人發現，ABCA1基因的R230C變異與早發2型糖尿病發病存在相關性[3]。在對日本人群的研究中發現，ABCA1基因5’端的單元型與糖尿病相關，且與血脂異常無關[4]。ALHARBI等[5]在對沙特人的研究中觀察到，ABCA1基因C69T基因型T等位基因可能是2型糖尿病的保護因素。上述遺傳學證據表明，ABCA1基因多態性與2型糖尿病發病有關。根據ABCA1基因與糖尿病及胰島β細胞的關系，人們開始對ABCA1基因多態性與磺脲類藥物療效的關系產生興趣。墨西哥AGUILAR-SALINAS等[13]研究發現，為達到相同的降糖效果，2型糖尿病患者中ABCA1的R230C等位基因比R230R需要更高劑量的格列本脲。不同種族的2型糖尿病的遺傳及其特點有差異，而且種族不同，基因多態性、基因分布特點也不完全相同。本研究結果顯示，漢族2型糖尿病人群存在ABCA1基因R219K多態性，分別為RR、RK和KK型，不同基因型患者在格列美脲治療12周后FBG、2 h-BG水平下降；治療12周后RK、KK基因型患者2 h-BG水平低于RR基因型患者。多元線性回歸分析結果顯示，格列美脲的療效在一定程度上取決于患者ABCA1基因R219K多態性，不同基因型個體對藥物的治療反應不同。其原因可能與ABCA1基因調節胰島β細胞分泌胰島素有關。有研究表明，胰島β細胞缺乏ABCA1蛋白會使細胞內微結構發生改變，導致胰島素合成和分泌障礙[14]。在對小鼠的研究中發現，ABCA1蛋白對胰島細胞分泌功能產生影響[15]。ABCA1蛋白可以減少胰島內膽固醇的蓄積、胰島炎癥[16]。體外實驗數據也表明，ABCA1蛋白可以通過影響高密度脂蛋白，而增加胰島細胞分泌胰島素[17]。

綜上所述，ABCA1基因R219K多態性與格列美脲降糖療效存在一定關系。不同基因型個體的藥物療效不同，RK、KK基因型患者的格列美脲降糖療效優于RR基因型患者。考慮研究對象相對較少，研究時間相對較短，希望今后增大樣本量，延長隨訪時間進一步證實。