索拉非尼對MHCC97-H肝癌細胞增殖、侵襲以及PRL-3蛋白表達的影響研究

馬盼，賈云宏

（1.錦州醫(yī)科大學研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學藥學院，遼寧 錦州 121001）

肝細胞癌進展的特點是細胞異常分化快，快速浸潤性生長，轉移早，惡性程度高，預后差。盡管肝移植、手術切除或肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization, TACE）治療可在一定程度上延緩病情的進展，然而治療肝細胞癌的最大障礙仍然是侵襲和轉移，近年來研究[1]證實，肝再生磷酸酶3（phosphatases of regenerating liver 3, PRL-3）是一種與腫瘤轉移相關的磷酸酶，它的過度表達增加癌細胞的運動和侵襲。索拉非尼作為一種新型的分子靶向藥物在臨床實踐中已顯示出顯著的療效。索拉非尼能否下調肝癌細胞中PRL-3的表達，降低肝癌細胞的侵襲力鮮見相關文獻報道，本研究旨在探討索拉非尼對MHCC97-H肝癌細胞增殖抑制情況，對PRL-3蛋白表達水平的影響，以及對肝癌細胞侵襲力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MHCC97-H肝癌細胞株購自上海細胞生物研究所，索拉非尼由德國拜耳公司生產(chǎn)，鼠抗人PRL-3多克隆抗體購自美國Bio Legend公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 37℃，5% CO2飽和濕度，DMEM培養(yǎng)液中生長，含有10%胚牛血清、青霉素100 u/ml及鏈霉素100 mg/L，消化傳代使用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA液。

1.2.2 實驗分組 索拉非尼由100%二甲基亞砜（DMSO）溶解，實驗組分別加入2、4、8和16 μmol/L的索拉非尼并且分別作用24、48和72 h以篩選最適合濃度和時間，對照組不加索拉非尼。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài) 準備鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板以便于對數(shù)生長期細胞接種，同時設陰性對照，加入FTY720，經(jīng)索拉非尼作用48 h，滴加無水乙醇風干后加瑞氏吉姆薩染液染色30 s，PBS浸泡2 min，洗去染液，固定、晾干、封片和鏡檢拍照。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制率 相同濃度MHCC97-H細胞懸液，實驗組加2、4、8和16 μmol/L的索拉非尼。每組設6個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μl的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后終止，棄其上清后每孔加入DMSO溶液150 μl震蕩溶解10 min。在490 nm波長處測定吸光度（A）值。細胞增殖抑制率=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.2.5 Western blot檢測PRL-3蛋白表達的變化 收集經(jīng)處理48 h的對照組，2、4、8、16 μmol/L的索拉非尼各組細胞，經(jīng)裂解及離心后收集上清進行蛋白定量；上樣緩沖液加入等量蛋白，煮沸、電泳及轉膜后加入PRL-3和β-action一抗4℃過夜，HRP標記二抗孵育2 h，最后用ECL發(fā)光，X射線膠片進行曝光、顯影、定影并應用AlphaEase FC軟件分析圖像。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 制備細胞懸液消化并且收集16 μmol/L的索拉非尼組細胞及對照組，調整細胞密度至5×104個/ml選取100 μl加入經(jīng)Matrigel包被的Transwell小室。放入細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去基質膠和上室內未穿膜的細胞，經(jīng)固定漂洗后給予0.1%結晶紫染色，PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨機觀察及計數(shù)5個視野細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用重復測量設計的方差分析和單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎上，采用LSD-t進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 索拉非尼對MHCC97-H細胞的抑制作用

不同濃度的索拉非尼作用于MHCC97-H肝癌細胞24、48和72 h的細胞增殖抑制率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同濃度索拉非尼的細胞增殖抑制率有差異（F=147.352，P=0.000）；②不同作用時間下細胞增殖抑制率有差異（F=214.016，P=0.000）；③不同濃度索拉非尼細胞增殖抑制率變化趨勢有差異（F=157.263，P=0.000）（見表1和圖1）。在本實驗的幾組濃度中篩選出索拉非尼進一步研究作用時間和濃度分別為48 h和16 μmol/L。

表1 索拉非尼對MHCC97-H細胞的抑制作用（%，±s）

表1 索拉非尼對MHCC97-H細胞的抑制作用（%，±s）

組別24 h48 h72 h 2 μmol/L17.56±2.6828.21±2.9331.55±3.12 4 μmol/L26.38±3.1937.96±3.3140.05±3.40 8 μmol/L32.09±3.4753.67±3.5655.32±3.76 16 μmol/L47.08±3.6963.88±3.8964.56±3.95

圖1 索拉非尼對MHCC97-H細胞的抑制作用

2.2 細胞形態(tài)

光鏡下對照組細胞無核碎裂及溶解（見圖2A），經(jīng)16 μmol/L索拉非尼作用48 h后可觀察大部分細胞發(fā)生凋亡，染色質固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)（見圖2B）。

圖2 MHCC97-H細胞形態(tài)圖（瑞氏-吉姆薩染色×200）

2.3 PRL-3的蛋白表達

各組PRL-3表達的水平，差異有統(tǒng)計學意義（F=394.769，P=0.000）。對照組中可見PRL-3條帶較粗，較強（見圖3），與對照組比較，2、4、8、16 μmol/L組中PRL-3灰 度 均 降 低（t=2.550、5.903、8.957和11.884，P=0.034、0.000、0.000和0.000）；與2 μmol/L組比較，4、8、16 μmol/L組中PRL-3灰度均降低（t=3.606、7.340和11.057，P=0.007、0.000和0.000）；與4 μmol/L組比較，8、16 μmol/L組中PRL-3灰度均降低（t=5.367和11.500，均P=0.000）；與8 μmol/L組比較，16 μmol/L組中PRL-3灰度降低（t=6.822，P=0.000）。濃度越高PRL-3蛋白表達量下降越明顯。見圖3和表2。

2.4 Transwell侵襲實驗結果

細胞侵襲實驗結果顯示，經(jīng)16 μmol/L索拉非尼作用48 h后，實驗組與對照組在穿過Transwell膜的肝癌細胞數(shù)進行比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.613，P=0.000），處理組穿膜細胞數(shù)低于對照組。見圖4。

圖3 不同濃度索拉非尼對PRL-3蛋白表達的影響

表2 經(jīng)索拉非尼作用后的PRL-3蛋白表達

圖4 索拉非尼抑制MHCC97-H肝癌細胞的體外侵襲能力

3 討論

3.1 肝癌的研究現(xiàn)狀

早期肝癌患者無明顯的癥狀，缺乏適當?shù)谋O(jiān)測和篩選制度，大多數(shù)患者錯過了最好的手術或肝移植機會。肝癌對放療和化療不敏感，其預后相對較差，主要是由于侵襲和轉移引起的快速進展。細胞信號轉導是一個復雜的多因素蛋白質網(wǎng)絡，其中信息被有效地通過上游因子的激活傳遞，并轉移到下游效應[2]。癌基因的異常表達是腫瘤形成、侵襲和轉移的關鍵。如果涉及腫瘤侵襲和轉移的基因被確定，分子生物學技術可糾正它們的表達水平，肝癌的侵襲和轉移可以減少，從而延緩該疾病的進展。在分子靶向治療的時代，確定預測的生物標志物是個性化醫(yī)學成功實施的關鍵。隨著對肝癌腫瘤異質性意義的進一步了解，腫瘤標志物的生物學特性可能是肝癌個性化靶向治療成功發(fā)展的一條途徑。隨著生物信息學技術的發(fā)展和完善，從細胞分子層面闡述腫瘤的作用機制，為分子靶向治療奠定了理論基礎。

通過識別異種腫瘤相關分子的驅動程序，分子靶向為腫瘤細胞的治療提供可觀的效果。識別腫瘤血管生成的作用改變以往對腫瘤的局限認識，新的分子靶向治療藥物的出現(xiàn)使得癌癥的治療取得革命性的進步[3]。目前有各種特定的和有效的單目標/單基因藥物，但他們的成本是相當昂貴的。此外，使用多個有針對性的靶向藥物，將不可避免地增加患者的身體負荷和經(jīng)濟負擔。因此，尋找高效能的多靶向藥物已成為治療癌癥患者的首要目標[4]。隨著醫(yī)療技術的進步，針對基因、受體和激酶的藥物已在臨床上應用，并在一定程度上為許多腫瘤的治療提供巨大的前景。采用分子標記或者腫瘤生物標志物來理解這種高度侵襲性的作用機制，可以預測腫瘤的預后，為開發(fā)新的治療方法提供重要的基礎研究。近年來開發(fā)的藥物靶向基因和激酶受體應用于臨床，推進癌癥的治療到一個前所未有的新階段[5]。

3.2 索拉非尼在治療肝癌方面的應用

肝癌靶向治療的關鍵是干擾腫瘤血管生成，目前所有新的藥物用于治療晚期肝細胞癌的療效以索拉非尼最為顯著[6]。索拉非尼能抑制PI3K/Akt、Ras/MAPK等通路，這將防止多藥耐藥途徑，有更高的療效和較低的不良反應[7-9]。一些研究還測試TACE聯(lián)合索拉非尼在肝癌伴門靜脈癌栓治療的安全性和有效性[10]，聯(lián)合治療肝癌可進一步提高療效[11]。索拉非尼在Raf/絲裂原活化蛋白轉導中起關鍵作用[12]，調節(jié)ERK激酶信號通路，從而降低Cyclin D1的表達和細胞周期阻滯。索拉非尼還可通過抑制酪氨酸激酶受體[13]抑制腫瘤血管生成，導致腫瘤組織缺血壞死。此外，索拉非尼也能通過MAPK依賴的機制抑制其活性，增加腫瘤細胞凋亡的內在途徑[14]。索拉非尼是多激酶的血管生成抑制劑，它已成為晚期肝細胞癌的標準治療[15]。盡管索拉非尼可以抑制腫瘤細胞通過多種信號轉導途徑，但沒有相關研究驗證是否能有針對性地抑制PRL-3通路。

3.3 PRL-3與腫瘤轉移的相關性

PRL-3是蛋白酪氨酸磷酸酶PRL亞組的一員，積極參與蛋白酪氨酸激酶信號通路的許多基本生理過程，調節(jié)多種酶的作用過程。越來越多的證據(jù)表明，PRL-3參與卵巢癌、胃癌、乳腺等[16-17]多種腫瘤細胞的增殖、生長調節(jié)、轉移和侵襲。PRL-3被證明是腫瘤復發(fā)與多種人類癌癥患者預后的有用指標。PRL-3在腫瘤血管生成及腫瘤侵襲性肝癌中起著關鍵的作用[18]，調節(jié)MMP-2、MMP-9和E-cadherin在肝癌中的功能。抑制PRL-3也降低IL-6誘導STAT3的磷酸化，從而調節(jié)機體自身的免疫狀態(tài)。最近一些研究[19]表明，PRL-3能夠控制多個信號通路，包括PI3K/Akt、Ras/MAPK和CSK/Src途徑，是細胞周期和細胞遷移的關鍵。PRL-3的高表達加速肝癌細胞侵襲、轉移，導致更差的預后。PRL-3也被證明在PI3K/Akt活性主要負調節(jié)蛋白表達水平增加，同時下調Akt的活化，降低磷酸酶和張力蛋白同源物。PRL-3能通過自分泌分泌腫瘤壞死因子-α和白細胞介素6，激活NF-κB信號通路，引起機體免疫系統(tǒng)的破壞和激發(fā)炎癥反應[20]。PRL-3已成為腫瘤轉移的重要標志物之一[21]。探索PRL-3作為藥物分子靶標抑制肝癌細胞侵襲與轉移已成為一種目前熱門課題。雖然大多數(shù)的腫瘤可以從單一的腫瘤細胞進化克隆，但所有的惡性腫瘤是遺傳不穩(wěn)定，導致顯著的生化異質性。雖然PRL-3是1個理想的分子靶點，其效用仍然不能令人滿意，主要由于腫瘤治療的特異性和敏感性鑒定缺乏。

3.4 本研究的意義和局限性

本研究發(fā)現(xiàn)本次實驗最佳干預索拉非尼濃度為16 μmol/L，最佳干預時間為48 h。索拉非尼作用后肝癌細胞出現(xiàn)典型的核碎裂及細胞凋亡形態(tài)；MHCC97-H細胞經(jīng)索拉非尼作用后PRL-3蛋白量下調，侵襲力受到明顯抑制，索拉非尼對肝癌細胞的抑制作用表現(xiàn)出一定的時間和劑量效應關系。索拉非尼可作用于多靶點，可能通過下調PRL-3蛋白從而減少肝癌細胞的侵襲，并誘導其凋亡。PI3K/Akt、Ras/MAPK等是索拉非尼和PRL-3調控的共同通路，此通路的抑制以及肝癌細胞侵襲力的下降可能是下調PRL-3蛋白，其作用機制需要進一步的探索。

綜上所述，PRL-3是肝轉移的重要調節(jié)因子，索拉非尼可下調PRL-3蛋白的表達從而減少肝癌細胞的侵襲，本研究為實現(xiàn)索拉非尼的工藝改進和集多靶點為一體奠定理論基礎。