恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定*

趙方　陳鵬　焦劍　胡明道　黃明　劉鋒　許曄凱

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科一病區(qū), 云南 昆明650101)

肝移植術(shù)后的排斥反應(yīng)是目前肝移植領(lǐng)域面臨的一大難題和挑戰(zhàn)。在臨床上, 術(shù)前及術(shù)后對于免疫抑制劑的使用多種多樣, 但長期用藥的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和全身免疫抑制帶來的副作用仍給患者帶來極大困擾。誘導(dǎo)免疫耐受被認(rèn)為是解決肝移植排斥反應(yīng)的理想方案[1-2]。通過基因工程誘導(dǎo)特異性免疫耐受來控制移植后的免疫排斥反應(yīng)可能是一種可行的方法[3]。TLR4信號傳導(dǎo)途徑在介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)中起重要作用[4], 而MyD88作為TLR4信號通路的接頭蛋白分子, 在通路信息傳遞中有關(guān)鍵性作用[5-6]。通過構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體來抑制MyD88分子的表達(dá), 進(jìn)而抑制TLR4 / MyD88 / NF-κB通路活化, 則可能降低移植免疫排斥反應(yīng)。本研究構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體, 為誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受的后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料腸桿菌TOP10菌種及293細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物學(xué)研究所提供, PCR用試劑primer(R&F)由上海吉凱基因公司合成, T4噬菌體DNA連接酶、10XT4噬菌體DNA連接酶緩沖液購自New England Biolabs(NEB)公司, 質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司, Invitrogen Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司, Adeno-XTM純化試劑盒購自Microbix 公司, BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自HyClone-Pierce 公司, 10×buffer、5×Taq buffer、dNTPs(2.5mM)、Taq polymerase購自Takara公司；羊抗鼠IgG購自Abcan公司；蛋白Marker(10～170kDa)購自Thermo公司。Western細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、SDS凝膠配置試劑盒、WesternⅠ抗稀釋液、WesternⅡ抗稀釋液、PMSF、Western封閉液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)、millipore顯影試劑盒購自碧云天公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1恒河猴MyD88RNAi穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 登陸美國國立生物信息中心(NCBI)查詢恒河猴MyD88的堿基序列和mRNA序列: GeneBank序列號為NM-001130681, mRNA: 891bp。針對目的基因序列, 恒河猴MyD88siRNA設(shè)計(jì)并合成為: GTACAAGGCAATGAAGAAA, 進(jìn)一步合成恒河猴MyD88RNAi基因片段(雙鏈DNA Oligo)如下：上游: 5′-CCGGAAGTACAAGGCAATGAAGAAACT CGAGTTTCTTCATTGCCTTGTACTTTTTTTG-3′, 下游: 5′TTCATGTTCCGTTACTTCTT TCTCGAGAAAGAAGTAACGGAACATGAAAAAAAC TTAA-3′。然后通過T4噬菌體DNA連接酶將GV119載體酶切后與MyD88siRNA鏈接后轉(zhuǎn)化CaCl2大腸桿菌TOP10菌種感受態(tài)細(xì)胞。對長出的陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定(陽性克隆PCR片段大小為 343bp；空載體克隆PCR片段大小為306 bp)；將陽性轉(zhuǎn)化子保存為甘油菌, 各分裝200μl進(jìn)行測序?qū)Ρ取?/p>

1.2.2重組腺病毒載體的包裝通過coli菌株DH5α擴(kuò)增腺病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝載體質(zhì)粒。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞, 以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度在35%左右, 重新接種于T25瓶, 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h左右待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。然后混勻穿梭質(zhì)粒5μg和輔助質(zhì)粒5μg與DMEM于離心管中, 調(diào)整體積為50μl。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻, 取10μl Lipofectamine 2000試劑在另一管中與50μl DMEM混合, 在室溫下溫育 5 min后, 與稀釋后的 DNA進(jìn)行混合, 以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。 將上述混合液轉(zhuǎn)移至 HEK293 細(xì)胞的培養(yǎng)液中, 混勻, 置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約10～15d后, 待大部分HEK293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE), 且有50%的細(xì)胞脫壁, 收集細(xì)胞重懸于2 ml DMEM中, -70℃/37℃反復(fù)凍融、震蕩3次, 于4℃ 7000g離心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。

1.2.3恒河猴MyD88腺病毒的擴(kuò)增和純化擴(kuò)增上述所得粗提液獲得更多的腺病毒載體, 首先, 稀釋HEK293細(xì)胞4倍后傳入另一個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中, 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合程度達(dá)到60%以上, 吸棄舊培養(yǎng)液, 加入復(fù)制缺陷型腺病毒重組成功后收獲的粗提液2 ml并孵育90 min, 最后, 補(bǔ)加3 ml DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE, 收集細(xì)胞并重懸于2ml DMEM中, -70℃/37℃反復(fù)冶融、振蕩 3 次, 于4℃ 7000 g離心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。重復(fù)上述步驟, 完成第二輪擴(kuò)增。將以上兩輪所得的病毒上清液按BD Adeno-X的步驟進(jìn)行純化并分裝, -70℃保存。

1.2.4重組腺病毒的滴度檢測按上述步驟純化重組腺病毒后感染HEK293細(xì)胞, 通過終點(diǎn)稀釋方法來算出病毒滴度。病毒滴度計(jì)算方法為: 病毒滴度=10(X+0.8)(PFU/mL), X=10-1～10-11依次稀釋細(xì)胞病變陽性率總和。

1.2.5MyD88蛋白表達(dá)的檢測前期實(shí)驗(yàn)已將恒河猴骨髓血進(jìn)行分離提純得到CD34+細(xì)胞[7]。將CD34+細(xì)胞種入12孔板中, 添加含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基, 并加入細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4(其濃度分別為100ng/ml、50ng/ml), 置于37℃、5%CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)；將培養(yǎng)至第7d的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行腺病毒的感染, 經(jīng)腺病毒感染效率檢測, 當(dāng)MOI為500～600時(shí)所構(gòu)建的腺病毒對恒河猴樹突狀細(xì)胞可獲得最佳感染效率。感染恒河猴樹突狀細(xì)胞48h后收集樹突狀細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測。

2　結(jié)果

2.1GV119載體的酶切及鑒定GV119載體質(zhì)粒經(jīng)單酶切消化后呈現(xiàn)均一的電泳條帶, 此時(shí)可與Marker對比判斷其分子量大小, 載體酶切產(chǎn)物大小約為 5.5kb, 與預(yù)期大小相符合, 見圖1A。

2.2MyD88目的基因真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞結(jié)果對照本實(shí)驗(yàn)受體細(xì)胞為E.coli DH5α菌株, 用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài), 然后與質(zhì)粒共保溫, 實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。恒河猴MyD88目的基因真核質(zhì)粒并帶有氨芐青霉素抗性基因, 對于含氨芐青霉素抗生素性質(zhì)的LB瓊脂培養(yǎng)基為陽性反應(yīng), 轉(zhuǎn)化組A中的菌落可以存活并分散生長, 說明轉(zhuǎn)化成功。因?yàn)闆]有氨芐青霉素抗性基因, 所以菌落無生長，見表1。雖然對照組C沒有氨芐青霉素抗性基因, 但其是處于不含氨芐青霉素抗生素性質(zhì)的LB瓊脂培養(yǎng)基上, 故可生長良好。對照組的結(jié)果可以證實(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中排除了除基因以外的其他干擾因素。

表1恒河猴MyD88目的基因真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞結(jié)果對照

Table1MucacamulattamyD88geneofeukaryoticplasmidtransformedEscherichiacolicompetentcells

　項(xiàng)目轉(zhuǎn)化組A對照組B對照組CLB瓊脂培養(yǎng)基抗性++-菌落抗性+--菌落轉(zhuǎn)化結(jié)果分散生長無生長成片生長

2.3恒河猴MyD88目的基因與GV119載體連接轉(zhuǎn)化子本實(shí)驗(yàn)以少許菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 圖1B中1為陰性對照, 我們采用最常用的ddH2O, 正常情況下圖1B中1 應(yīng)無任何條帶, 若有條帶則為假陽性, 可能為試劑被模板污染等。圖1B中2為空載體自連對照組, 因載體帶的目的基因siRNA較短， 且引物設(shè)計(jì)在載體上, 所以空載體也有片段。圖1B中3為Marker, 自5kb至100bp。圖1B中4～8為帶有目的基因的質(zhì)粒載體。電泳分析檢測, 可見陽性克隆PCR片段大小約343bp, 空載體克隆PCR片段大小為306bp, 與理論條帶大小一致, 見圖1B。

2.4恒河猴MyD88RNAi真核質(zhì)粒陽性克隆測序圖及結(jié)果分析挑取重組陽性克隆, 接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng), 抽提質(zhì)粒后測序, 測序結(jié)果顯示前期實(shí)驗(yàn)所得恒河猴MyD88-RNAi序列與本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驕y序所得序列一致, 無突變或移碼, 進(jìn)一步確定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為我們所要得到的目的基因, 表明成功構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒。該測序結(jié)果圖由綠、紅、藍(lán)和黑色測序峰組成, 代表不同的堿基序列。該圖中峰型正常, 未見異常雜帶, 見圖1C。

2.5腺病毒滴度觀察情況 將重組穿梭質(zhì)粒MyD88siRNA和骨架質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染, 48 h后在熒光顯微鏡下見HEK293細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá), 直到病毒稀釋至10-11時(shí)與空白對照對比不明顯, 可計(jì)算樣品腺病毒滴度大致為2.0E+10pfu/ml, 見圖2。

2.6MyD88siRNA對MyD88蛋白表達(dá)作用在image quent成像系統(tǒng)下進(jìn)行曝光, 可見33kD處出現(xiàn)特異性條帶, 在43kD處可見β-actin內(nèi)參成功表達(dá), 干擾組MyD88蛋白的表達(dá)明顯降低, 可推斷MyD88siRNA對樹突狀細(xì)胞中的MyD88蛋白表達(dá)具有抑制作用, 見圖1D。

圖1　恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體的鑒定Figure1　Identification of adenovirus vector of mucaca mulatta myD88 gene silencing

注: A.GV119載體, Age I/ EcoR I酶切電泳圖; B.恒河猴MyD88-RNAi轉(zhuǎn)化子電泳圖； C.恒河猴MyD88-RNAi測序圖； D.western blot鑒定MyD88在imDC中的表達(dá)

圖2　腺病毒滴度觀察Figure 2　Adenovirus titer observation

注: a、b、c、d、e、f分別是稀釋病毒原液至10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11時(shí)熒光顯微鏡下觀察的情況(×100), g是空白對照

3　討論

目前國內(nèi)外嚙齒類動物尤其小鼠關(guān)于腺病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫耐受的報(bào)道較多, 相關(guān)結(jié)果卻多缺乏臨床應(yīng)用價(jià)值, 究其原因在于嚙齒類動物在基因相似度上和人吻合度高, 但免疫系統(tǒng)和人類卻有較大差異, 因此采用和人類高度相似非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物恒河猴進(jìn)行免疫相關(guān)研究有重要意義。目前恒河猴免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)染病毒載體構(gòu)建報(bào)道少見, 本研究構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體, 為下一步用于誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受奠定基礎(chǔ), 具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

腺病毒載體是目前基因工程中廣泛使用的病毒載體之一, 腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因效率較高, 體外實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常接近100%；而且可以對不同類型的人組織細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo), 不會受到靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限制；能夠比較容易得到高滴度病毒載體, 在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(dá)(10E+11)/ml；其進(jìn)入細(xì)胞后并不整合到宿主細(xì)胞基因組, 快速表達(dá), 安全性較高[8-9]。在基因治療臨床試驗(yàn)方面腺病毒載體已經(jīng)得到了越來越多的應(yīng)用, 成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后最具前景的病毒載體[10-11]。而且腺病毒載體也被廣泛用于RNAi中[12], 這也是本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒作為載體的原因之一。

MyD88是TLR信號通路的重要信號成員, 在該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[13-14]。基于此觀點(diǎn), 在本實(shí)驗(yàn)中我們將MyD88作為研究靶點(diǎn), 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制MyD88的表達(dá)以期達(dá)到在末端MyD88水平阻斷TLR信號通路的目的。

通過前期試驗(yàn)工作篩選得到有效恒河猴MyD88RNAi真核質(zhì)粒載體, 而后進(jìn)行設(shè)計(jì)合成。在恒河猴MyD88siRNA腺病毒載體的制備過程中, 菌落PCR電泳分析檢測, 可見擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性條帶, 陽性克隆PCR片段大小與理論值相符合。隨后的陽性克隆測序中, 測序結(jié)果顯示前期實(shí)驗(yàn)所得恒河猴MyD88-RNAi序列與本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驕y序所得序列一致, 無突變或移碼, 進(jìn)一步確定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為我們預(yù)期目的基因一致, 表明成功構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒。最后將恒河猴DC經(jīng)MyD88siRNA腺病毒載體感染48h后, 進(jìn)行WB檢測, 結(jié)果顯示干擾組蛋白表達(dá)降低, 由此可推斷MyD88siRNA對恒河猴樹突狀細(xì)胞中的MyD88蛋白表達(dá)具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)后續(xù)采用MyD88siRNA腺病毒載體感染恒河猴imDC, 從而體外實(shí)驗(yàn)觀察其對恒河猴imDC生物學(xué)特性的影響, 為臨床肝移植提供了一個(gè)新的治療途徑。

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 成功構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體,MyD88siRNA對恒河猴樹突狀細(xì)胞中的MyD88蛋白表達(dá)具有抑制作用, 為研究肝移植免疫耐受提供了基礎(chǔ)路徑。 此實(shí)驗(yàn)使用的是與人類基因排列高度相似的非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物恒河猴, 較其他實(shí)驗(yàn)動物有較大的優(yōu)越性。恒河猴生理上與人類接近, 是較理想的肝移植免疫耐受模型的實(shí)驗(yàn)動物[15-18], 目前國內(nèi)外有關(guān)牛、綿羊、禽類尤其是小鼠關(guān)于腺病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫耐受的報(bào)道較多, 但是恒河猴MyD88 siRNA腺病毒載體構(gòu)建并用于誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受的研究報(bào)道相當(dāng)少見[19-21], 因此, 構(gòu)建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒載體為誘導(dǎo)恒河猴肝移植免疫耐受奠定了重要基礎(chǔ)。