被動吸煙對大鼠心肌組織 心室結構及血清標志物的影響*

趙佳　江鳳　夏紀筑　蔣松辰　王文淵

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 四川 瀘州 646000)

吸煙是人類健康的致命殺手。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，截至2015年，全球吸煙人數(shù)達10億，全球十分之一的死亡與吸煙有關[1]。而在我國，現(xiàn)有吸煙人數(shù)已超過3億，同時有7.4億非吸煙者遭受被動吸煙的危害，每年死于吸煙相關疾病的人數(shù)超過100萬[2]。目前有臨床研究顯示，吸煙與低濃度的超敏肌鈣蛋白增加相關，表明煙草煙霧中的物質(zhì)可能損傷心肌細胞[3]。同時Wilson等[4]在對社區(qū)動脈粥樣硬化風險(Atherosclerosis Risk in Communties，ARIC)研究中對數(shù)千名參與者的心臟及其功能進行研究，發(fā)現(xiàn)吸煙與心室壁變厚及心臟泵血能力下降存在關聯(lián)，這兩個因素與心衰風險增加相關。本研究通過觀察被動吸煙對大鼠心肌及血清標志物的影響，探討被動吸煙對心臟的危害。

1　材料與方法

1.1實驗材料清潔級健康雄性SD大鼠20只，購于西南醫(yī)科大學動物房；天下秀牌香煙(焦油量：10mg，煙氣煙堿量：1.0mg，煙氣一氧化碳量：11mg，過濾嘴卷煙)由四川中煙工業(yè)有限責任公司出品；腦鈉肽(BNP)、大鼠肌鈣蛋白T(Tn-T)Elasa試劑盒購于武漢拜意爾生物科技有限公司。

1.2實驗分組7周齡SD雄性大鼠20只，體重(200±20)g，按隨機數(shù)字表法分為兩組：實驗組10只，對照組10只。

1.3實驗方法

1.3.1被動吸煙將大鼠裝入自制玻璃裝置給予被動吸煙，該裝置大小為60cm×50cm×50cm，頂部開有數(shù)個1cm×1cm通氣口。每天2次，兩次間隔6h，每次共燃燒10只煙，持續(xù)1h(箱內(nèi)放置無水氯化鈣吸收水蒸氣，將2支香煙點燃形成煙霧，并保持均勻，煙霧暴露過程中箱內(nèi)氧濃度維持在20%)，每周5d，共持續(xù)12周。對照組予以正常空氣對照。

1.3.2飼養(yǎng)及取材方法兩組大鼠采用同等方式飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學忠山校區(qū)動物房，日夜交替。供給大鼠標準動物飼料(購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心)和自來水，自由取食水。于4、8、12周時禁食8h后稱重，8、12周時麻醉(1%苯巴比妥 40mg/kg)后行小動物心臟彩超，12周時心臟彩超后取血及心臟，心臟經(jīng)甲醛固定，包埋，行心肌HE染色，血4℃ 2000r離心10min后收集上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑱z測大鼠血清BNP及Tn-T。

1.3.3心臟彩超檢查心室結構大鼠麻醉后固定，應用心臟彩超(VIVID，GE E9 Vingmed ultrasound)探頭頻率12MHz,取胸骨旁左室長軸切面，在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲運動曲線后，分別測量大鼠左心室舒張末期容積(LVIDd)、左室收縮末期容積(LVIDs)、舒張期室間隔厚度(IVSD)、收縮期室間隔厚度(IVSS)，計算左室射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。各指標在連續(xù)3個心動周期上測量后取其平均值。

1.3.4血清BNP及Tn-T測定具體操作參照Elisa試劑盒說明書。BNP:在各孔中加入標準品或樣品各50μl,立即加入50μl生物素化抗體工作液，37℃孵育45min后洗滌3次，再加入100μl酶結合物工作液，37℃孵育30min，洗滌5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl終止液，立即在450nm波長處測量OD值，計算出BNP含量。Tn-T：在各孔中加入標準品或樣品各100μl，立即加入100μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60min后洗滌3次，再加入100μl酶結合物工作液，37℃孵育30min，洗滌5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl終止液，立即在450nm波長處測量OD值，計算出Tn-T含量。

1.3.5HE染色取大鼠心臟，心肌經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋,切片，常規(guī)脫蠟至水，先后經(jīng)蘇木素-伊紅染色，梯度酒精常規(guī)脫水，中性樹膠封片等步驟。采用光學顯微鏡拍照，觀察心肌組織病理結構的改變。

2　結果

2.1被動吸煙對大鼠體重的影響與對照組相比，在第8周和第12周時被動吸煙對大鼠體重有顯著地抑制作用(P=0.006<0.01或P=0.015<0.05)，但在4周時實驗組與對照組大鼠的體重無差異(P=0.098)，見表1。

表1　兩組大鼠體重比較Table 1　Comparison of body weight between the two groups

注：與對照組相比，①<0.05，②P<0.01

2.2被動吸煙對大鼠心室結構的影響與對照組相比，實驗組大鼠在第12周時具有更大經(jīng)體重調(diào)整后的左室舒張末期容積(P=0.033<0.05)、收縮末期容積(P=0.022<0.05)及室間隔厚度(P=0.016<0.05或P=0.048<0.05)，隨著實驗時間的延長，被動吸煙組大鼠的左室舒張末期容積增加(P=0.047<0.05)，見表2。

2.3被動吸煙對血清標志物(BNP及Tn-T)的影響與對照組相比，實驗組大鼠血清BNP及Tn-T濃度明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表3。

2.4被動吸煙對大鼠心肌的影響對照組大鼠心肌結構正常，橫紋清晰，核居中，間質(zhì)為少量血管及結締組織，見圖1A；實驗組大鼠心肌細胞排列紊亂，心室肌細胞纖維分離及纖維部分斷裂，血管淋巴細胞浸潤，血管內(nèi)含大量紅細胞，見圖1B～D。

表2　不同時間兩組大鼠心室結構比較Table 2　Comparison of echocardiographic study between the two groups

注：IVSD：舒張期室間隔厚度；IVSS：收縮期室間隔厚度；LVIDd：左室舒張末期容積；LVIDs：左室收縮末期容積；BW：體重；EF：左室射血分數(shù)；FS：左室短軸縮短率。與對照組相比，①P<0.05，與不同時間實驗組相比，②P<0.05

Table3ComparisonofBNPandTn-Tinsecrumbetweenthetwogroups

指標　對照組　實驗組BNP(pg/ml)70.096±4.392106.198±8.453Tn-T(pg/ml)99.414±9.201①156.570±5.341①

注：BNP正常值：<80ng/ml；Tn-T正常值：<110pg/ml。與對照組相比，①P<0.001

3　討論

圖1　兩組大鼠心肌的比較Figure 1　Comparison of biochemical histopathological studies between the two groups

吸煙會引起急慢性疾病，最先被熟知的是其與肺部腫瘤的關系。直到19世紀60年代，其與心血管疾病的關系仍具爭議。后來研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是心血管疾病的危險因子。最早研究認為，香煙中的活性物質(zhì)-尼古丁對交感神經(jīng)系統(tǒng)有刺激作用，通過增加血壓、心率以及心搏量影響心血管系統(tǒng)；還認為吸煙通過血管舒縮障礙、凝血活性異常、血小板激活、白細胞活化、脂質(zhì)過氧化以及平滑肌增殖導致氧化應激增加炎癥及栓塞風險[5-6]。近年有臨床研究顯示，吸煙與低濃度的超敏肌鈣蛋白增加相關，表明煙草煙霧中的活性物質(zhì)可能損傷心肌細胞[3]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙與心室壁變厚及心臟泵血能力下降相關[6]，這兩個因素與心衰風險增加相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠體重在4周時無明顯差異(P>0.05)，但在8周及12周時有明顯的差異(P<0.05)，提示被動吸煙可能影響大鼠的生長；且隨時間的增加，影響越明顯。這與梁會鵬等[7]研究結果一致。對于被動吸煙影響體重的具體機制尚不明確，可能與以下因素相關：①香煙燃燒過程中氧氣減少，煙霧中CO與血液中的血紅蛋白結合，導致機體缺氧，進而導致食欲降低。②煙霧中的尼古丁增加交感神經(jīng)活性，促進兒茶酚胺釋放，增加基礎代謝率。有研究表明，尼古丁會通過興奮交感神經(jīng)導致糖皮質(zhì)激素與生長激素增加，從而導致胰島素抵抗，進而影響代謝，而不是通過影響胰島素分泌[8]，但是這一結論還存在爭議。Moustafa等[9]研究結果顯示，吸煙組大鼠與非吸煙組大鼠體重沒有明顯的變化，這可能是該研究觀察時間較短，持續(xù)時間僅1個月，而本實驗觀察時間持續(xù)3個月。

通過對大鼠心臟彩超進行分析后發(fā)現(xiàn)，8周時兩組大鼠心臟結構未出現(xiàn)明顯改變。而在12周時，實驗組具有更大的經(jīng)體重調(diào)整后的心室收縮末期容積及舒張末期容積(P<0.05)，這與國外學者研究結論相同[10-11]。不同的是，本研究時間較Castardeli短，同時還得出被動吸煙12周，經(jīng)體重調(diào)整后的被動吸煙組大鼠具有更大的室間隔厚度(P<0.05)，雖未能發(fā)現(xiàn)其他指標(如EF及FS等)出現(xiàn)明顯改變，但發(fā)現(xiàn)隨被動吸煙時間延長，實驗組大鼠左室舒張末期容積增加(P<0.05)，這表明被動吸煙會影響心室重塑的過程。心功能進行性降低是心室重塑的顯著特點，同時心室結構改變會促進心功能障礙[12-13]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)心功能降低，可能是因為早期的細胞生長及重塑有助于維持心功能。我們在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，被動吸煙4個月后大鼠室間膈及室壁厚度在肉眼觀上已經(jīng)明顯比正常大鼠肥厚，但不足的是未行心臟彩超檢查。

本研究發(fā)現(xiàn)，被動吸煙組大鼠血清BNP濃度較正常空氣對照組增加,提示煙草煙霧中的物質(zhì)促進了BNP分泌或抑制了BNP清除。促進BNP分泌的可能機制為長期香煙煙霧暴露導致機體血壓升高，增加心室壓力負荷，導致心室分泌BNP增加；同時較高的血壓對血管壁存在剪切力，導致血管內(nèi)皮細胞損傷，促進BNP的釋放。Talukder等[14]研究證實，煙草煙霧暴露刺激了交感神經(jīng)系統(tǒng)，增加了兒茶酚胺濃度，導致血壓升高。該研究還證實其能增加氧化應激及降低NO生物利用度，引起內(nèi)皮功能障礙及心室重構。而目前尚無探討香煙煙霧暴露是否抑制BNP清除的研究。被動吸煙組大鼠血清TnT濃度較正常空氣對照組增加，提示香煙煙霧導致心肌細胞損傷，其機制是煙草燃燒后產(chǎn)生的污染物增加了氧化應激和產(chǎn)生過度的自由基，故推測可能是氧化應激產(chǎn)生的炎癥因子及過度的自由基導致了心肌細胞損傷[15]。Ambrose等[16]研究表明，香煙煙霧導致氧化應激表現(xiàn)為炎癥和栓子形成，機制是通過血管舒縮障礙、促凝過程、血小板激活、白細胞活化和平滑肌增殖而實現(xiàn)的。

本研究對大鼠心肌病理檢測發(fā)現(xiàn)，被動吸煙會引起心室肌細胞纖維分離及纖維的部分斷裂，血管淋巴細胞浸潤及血管內(nèi)充血，這與文獻報道符合[17]。Hariri等[18]研究發(fā)現(xiàn)，于香煙煙霧暴露1個月后出現(xiàn)心肌肥厚、炎癥、纖維化、動脈粥樣硬化、主動脈鈣化的改變，本研究也得到了部分結論。該研究還發(fā)現(xiàn)，氧化應激的程度與冠脈疾病嚴重程度相關，并導致血管疾病、動脈粥樣硬化和高血壓的進展。Talukder等[14]研究表明，繼發(fā)于吸煙的高血壓、心臟肥大和重塑的原因是心血管系統(tǒng)氧化應激的增加；吸煙會導致心室細胞超微結構的改變，如心肌細胞線粒體損傷、部分破壞或者消失，從而影響Z線[17]。本研究發(fā)現(xiàn)被動吸煙導致心室結構的改變，推測其機制可能是通過香煙燃燒產(chǎn)生的有毒物質(zhì)導致氧化應激及過度的自由基損傷心肌細胞；同時血壓升高引起血管內(nèi)皮損傷及增加壓力負荷，導致BNP及肌鈣蛋白的改變。但其具體機制仍需進一步的研究證實。

4　結論

本研究結果顯示，長期被動吸煙會導致心肌組織、心室結構改變及影響血清標志物濃度，影響心室重塑。而因為煙草燃燒產(chǎn)生的煙霧中許多有毒的成分已被證明可以引起炎癥、過敏、窒息、癌變，如尼古丁、焦油、苯、甲醛、苯并芘、一氧化碳、氰化物及丙烯醛等，所以本研究存在局限性，特別是由于方法學原因，所采取被動吸煙方式引發(fā)造成大鼠的心肌組織、心臟功能及損傷標志物的變化因素較多，可能為上述有害成分的綜合作用結果。所以，下一步研究可進一步在細胞學、分子結構方面探討其毒理學機制。