漢族人群乙型肝炎病毒感染者外周血IL-28B基因多態性研究*

談國蕾，孫梅，王建芳，吳旭平

HBV感染所致的肝硬化（liver cirrhosis，LC）、肝衰竭（liver failure，LF）和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）較為常見[1]。白細胞介素 -28B（in terleukin 28B，IL-28B）基因作為一個重要的細胞因子基因，具有影響抗病毒和免疫調節等作用，在HBV感染進程中有著重要的作用[2，3]。本研究檢測了HBV感染者外周血IL-28B基因rs8099917和rs12979860多態性，以探討其與乙型肝炎病程進展的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究對象為2013年1月～2014年12月南京市第二醫院門診及住院的HBV感染者。按照2010年中華醫學會肝病學分會和感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]對疾病診斷并分組如下：無癥狀攜帶者（asymptotic HBV carriers，ASC）45例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者181例，LC患者69例，HCC患者79例，LF患者79例。另選同期在我院健康體檢者145例作為對照。所有人群無重疊或混合其他病毒感染，入選對象均為江蘇籍漢族人群。

1.2 外周血IL-28B基因多態性檢測 取外周血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的DNA Blood Kit提取DNA，直接用于PCR擴增或者保存于-20℃備用。根據NCBI上IL-28B基因序列設計引物。rs12979860位點上游引物rs860-F：CTTATCGCATACGGCTAGGC，下游引物 rs860-R：GGACCGCTACGTAAGTCACC。rs8099917位點上游引物rs917-F：TTCACCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引 物 rs917-R：TCCTAAATTGACGGGCCATCTGTTTC。引物由上海英駿生物技術有限公司（Invitrogen）合成。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃30 s，55℃ 30 s,72℃ 30 s；共 35 個循環，最后，72℃延伸5 min。取PCR產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定擴增結果。PCR產物用QIAGEN公司QIA Quick PCR Purification kit進行產物純化。將純化后的PCR產物送南京金思瑞生物科技公司測序。分析和記錄IL-28B rs8099917和rs12979860位點的基因型和等位基因。

1.3 統計學分析 采用Pearson x2檢驗對IL-28B rs8099917與rs12979860位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計量資料以（±s）表示，計數資料采用例數表示。應用SPSS 17.0軟件進行方差分析、x2檢驗和Binary Logistic回歸分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組人群的臨床特點 453例HBV感染者年齡和性別比較見表1，ASC患者中男性比例顯著少于健康人群（x2=10.991，P=0.001），LC 患者中男性比例顯著高于健康人群（x2=7.684，P=0.006）。LC患者、HCC患者和LF患者的年齡顯著大于健康人群（P＜0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 對健康人群IL-28B基因2個位點分別進行平衡檢驗，經擬合優度x2檢驗，各個基因型分布實際值近似于推算獲得的期望值，提示這些rs8099917與rs12979860位點處于遺傳平衡狀態（P＞0.05），表明用于本研究的對照樣本具有群體代表性，對照組中多態性位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果見表2。

表1 各組人群年齡和性別（n,±s）比較

表1 各組人群年齡和性別（n,±s）比較

與健康組比，①P<0.05

健康人（n=145） ASC（n=45） CHB（n=181） LC（n=69） HCC（n=79） LF（n=79）性別（男/女） 98/47 18/27① 135/46 59/10① 63/16 54/25年齡(歲) 35.3±14.2 35.7±8.6 36.6±12.5 47.8±11.3① 55.5±10.0① 45.8±12.8①

表2 對照人群多態性位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果

2.3 rs12979860位點基因型和等位基因分布情況 在本地區人群中，IL-28B基因rs12979860位點有三種基因型，即CC、CT和TT，以CC和CT為主要基因型，TT型只在健康人群和CHB患者中存在。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者CC型頻率與健康人群無顯著性差異（P=0.797，P=0.422，P=0.428，P=0.997），只有LF人群中CC型頻率顯著高于健康人群（P=0.045），提示CC型與LF的患病風險有關（OR=0.257）。ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者C等位基因頻率與健康人群無顯著性差異（P=0.685，P=0.406，P=0.352，P=0.907），只有 LF 患者顯著高于健康人群（P=0.038），提示C等位基因與LF的患病風險有關（OR=0.255，表3）。

表3 IL-28B基因rs12979860基因型和等位基因頻率（%）分布

2.4 rs8099917位點的基因型和等位基因分布情況 在本地區人群中，IL-28B基因rs8099917位點有三種基因型，即 TT、TG、GG，以 TT、TG 為主要基因型。GG型只在健康人群和CHB患者中存在。LC患者TT型頻率顯著高于健康人群（P=0.041），而ASC、CHB患者、HCC患者、LC患者與健康人群無顯著性差異（P=0.414，P=0.245，P=0.179，P=0.323），提示TT型與肝硬化的患病風險有關（OR=0.288）。ASC、CHB患者、HCC患者、LF患者與健康人群差異均不具有統計學意義（P=0.540，P=0.245，P=0.166，P=0.264），只有LC患者T等位基因比例顯著高于健康人群（P=0.036），提示T等位基因與LC的患病風險有關（OR=0.299，表 4）。

表4 IL-28B基因rs8099917基因型和等位基因頻率（%）分布

3 討論

本研究分析了IL-28B基因2個SNPs位點（即rs8099917和rs12979860）在健康人群與ASC患者、CHB患者、LC患者、HCC患者和LF患者中的分布。結果表明，在健康人群和CHB患者或HCC患者中這兩個位點分布都無顯著性差異，即rs8099917和rs12979860位點多態性與HBV感染引起的CHB或HCC無明顯相關。本研究發現的這個結果與國外學者]在健康人群和CHB患者中的結果，rs8099917和rs12979860基因型和等位基因分布無顯著性差異是一致的[5-9]。

但是，IL-28B rs12979860和rs8099917多態性與HCC是否相關有著不同的結論。其他相關研究[10-12]表明，IL-28B rs12979860位點T等位基因在HCC患者中更普遍存在，而本研究與Akkiz[13]發現的rs-12979860位點在健康人群和HCC患者無顯著性差異的結果是一致的。尚有其他報道[8,14，15]發現該位點在HCC患者和LC患者中都無顯著性差異。此外，國內哈明昊[16]報道，IL-28B rs12979860位點T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者中無顯著性差異，可能不是病情進展的影響因素，與本文研究結果是不一致的。本研究還發現IL-28B rs12979860位點在健康人群和LF患者中有顯著性差異，C等位基因的HBV攜帶者罹患LF的風險增加。是否與LF相關的報道較少，本研究的下一步將進一步擴大LF患病人群，研究LF發生發展的機理及其與遺傳基因的相關性問題。

本研究發現IL-28B基因rs8099917位點在LC患者與健康人群有顯著性差異，即IL-28B rs8099917位點T等位基因的攜帶者罹患LC的風險增加。Kimkong et al報道[11]在臺灣地區，相對于健康人群組，IL-28B T等位基因都是乙型肝炎病程進展的易感基因，T等位基因是CHB的易感基因，但不是LC和HCC的易感基因。Kim et al[17]報道，相對于正常人，攜帶T等位基因者罹患HCC的風險增加。哈明昊[16]報道，T等位基因在ASC人群、CHB患者和LC患者無顯著性差異。也有與之不一致的報道，比如Hodo et al[18]發現T等位基因是肝癌的高風險基因，而Lee et al[14]報道該點在HCC患者和LC患者中都無顯著性差異。國內王艷[19]報道IL-28B G是發生HCC的高風險基因，T則是保護性基因。這些在不同地區和不同人群研究結果的差異，提示IL-28B基因多態性導致乙型肝炎病情進展仍存在較多的爭議。

綜上所述，通過本研究發現了人外周血IL-28B rs8099917和rs12979860基因多態性與HBV感染后的病情進程有一定的關聯，且可能受到不同地區不同種族人群遺傳結構的影響，以及研究對象樣本量的影響，其具體機制仍有待進一步研究。